Aktuell†Aktuell Adress: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
De Reaktiounszentrum Liicht-Erntekomplex 1 (RC-LH1) ass déi zentral photosynthetesch Komponent vu purpurroude phototrophe Bakterien. Mir hunn zwou Kryo-Elektronemikroskopiestrukture vum RC-LH1-Komplex aus Rhodopseudomonas palustris agefouert. Déi 2,65-Å Opléisungsstruktur vum RC-LH114-W-Komplex besteet aus 14 Ënnereenheeten LH1-Schleifen, déi RC ëmginn, deen duerch Protein W ënnerbrach gëtt, während de Komplex ouni Protein-W komplett aus RC-Zesummesetzung besteet, déi vun RC ëmginn ass. Eng zougemaach 16-Ënnereenheeten LH1-Schleif. De Verglach vun dëse Strukturen gëtt Abléck an d'Dynamik vum Chinon am RC-LH1-Komplex, dorënner virdru onbekannt Konformatiounsännerungen bei der Bindung vu Chinon un der RC QB-Plaz, souwéi d'Lokalisatioun vun den zousätzleche Chinon-Bindungsplazen, déi hëllefen, se un RC weiderzeginn. Déi eenzegaarteg Struktur vum W-Protein verhënnert d'Schließung vun der LH1-Schleif, wouduerch e Kanal fir d'Beschleunegung vum Chinon/Chinolon-Austausch entsteet.
D'Energie, déi duerch d'Photosynthese geliwwert gëtt, kann bal all Liewen op der Äerd erhalen, an et huet e grousst Potenzial fir d'Solarbiotechnologie. Wärend si déi global Fotosynthese förderen, weisen violett phototroph Bakterien och verschidden Energiemodi a metabolesch Fäegkeeten. Si kënnen d'Photosynthese vermeiden a wuessen als heterotroph Bakterien am Däischteren, kënne Stéckstoff a Kuelendioxid fixéieren, Waasserstoff produzéieren an aromatesch Verbindungen ofbauen (1-3). Fir Energie fir dës Prozesser ze liwweren, muss d'Liicht séier an effizient a chemesch Energie ëmgewandelt ginn. Dëse Prozess fänkt un, wann de Liichtfangende Antennekomplex Liicht absorbéiert an déi agefaangen Energie un de Reaktiounszentrum (RC) iwwerdroen, wouduerch d'Ladungstrennung ufänkt (4-7). Déi grondleeënd Eenheet vun der Fotosynthese a violett phototrophesche Bakterien besteet aus Typ 2 RC, ëmgi vum Liichterntekomplex 1 (LH1), wat de RC-LH1 Kärkomplex bildt. LH1 gëtt aus enger Rei vu gekrëmmte αβ Heterodimeren geformt, déi all zwee bakteriell Chlorophyll (BChl) α-Moleküle an een oder zwee Carotinoiden (8-12) binden. Déi einfachst LH1-Antenn besteet aus 16 oder 17 αβ-Heterodimeren, déi RC (9-13) an enger zouener Schleif ëmginn, awer an anere Kärkomplexer ënnerbriechen transmembran Peptide d'Kontinuitéit vum ëmleiende LH1, wouduerch d'Chinol/Chinon-Diffusioun tëscht RC an dem Cytochrom-bc1-Komplex gefördert gëtt (11, 13-15). Déi violett phototrophesch Planz Rhodopseudomonas (Rps.) ass e Modellorganismus, deen den Energie- an Elektronentransfer verstoe kann, deen d'Photosynthese ënnerstëtzt. Déi éischt Kristallstruktur vun Rps. De Modell vum palustris RC-LH1-Komplex ass RC, ëmginn vun 15 heterodimeresche LH1-Schleifen, déi vun engem onbekannte Protein mam Numm "Protein W" ënnerbrach sinn (14). Protein-W gouf spéider als RPA4402 identifizéiert, wat en oncharakteriséiert 10,5 kDa Protein mat dräi virausgesoten transmembrane Helixen (TMH) ass (16). Mir proposéieren, den rpa4402-Gen, deen de Protein W kodéiert, a pufW ëmzebenennen, fir mat der Nomenklatur konsequent ze sinn, déi fir Genen benotzt gëtt, déi fir RC-L-, M- (pufL, pufM) an LH1α, β- (pufA, pufB) Ënnereenheeten kodéieren. Interessanterweis ass de Protein-W nëmmen a ronn 10% vum RC-LH1 präsent, wat weist, datt Rps. palustris zwou verschidde RC-LH1-Komplexe produzéiert. Hei presentéiere mir déi héichopléisend Kryo-EM (Kryo-EM) Strukturen vun zwou Kärkomplexe, eng mat Protein W an 14 αβ Heterodimerer, déi aner ouni Protein W an eng zougemaach 16-Heterodimer LH1-Schleif. Eis Struktur stellt eng schrëttweis Ännerung am Versteesdemech vum RC-LH1-Komplex vun Rps. palustris duer, well mir déi homogen Populatioun vun all Variant analyséiert hunn a genuch Opléisung hunn, fir all Peptid a gebonne Pigmenter a verwandte Lipiden a Chinonen kloer zouzeweisen. De Verglach vun dëse Strukturen weist, datt déi dräi TMH-Proteinen-W, déi bis elo an kengem aneren RC-LH1-Komplex fonnt goufen, e Chinonkanal generéieren, fir den Chinon/Chinolon-Austausch ze beschleunegen. Eng Rei vu konservéierte Lipid- a Chinon-Bindungsplazen goufen identifizéiert, a mir hunn eng nei Konformatiounsännerung no der Kombinatioun vu Chinon an RC opgedeckt, déi fir Photosystem II (PSII) RC vu sauerstoffräiche phototrophen Organismen gëeegent kéint sinn. Eis Erkenntnisser bidden nei Abléck an d'Kinetik vun der Chinon/Chinolon-Bindung an -Austausch am RC-LH1-Kärkomplex vu purpurroude phototrophe Bakterien.
Fir eng detailléiert Studie vun den zwou Komplexer, déi an Rps. palustris fonnt goufen, ze erliichteren, isoléiere mir all RC-LH1 duerch biochemesch Methoden. De protein-W-defiziente Komplex (am weidere als ΔpufW bezeechent) gouf vum Stamm gereinegt, deen de pufW-Gen feelt (16), an nëmmen ee RC-LH1-Komplex kann produzéiert ginn. De protein-W-haltege Komplex gëtt vun engem Stamm produzéiert. De Protein-W vun dësem Stamm gëtt mat engem 10x His-Tag op sengem C-Terminus modifizéiert, sou datt de protein-W-haltege Komplex effektiv mat de meeschte feelenden Protein-W kombinéiert ka ginn, andeems Metall immobiliséiert gëtt. De Komplex gëtt effektiv getrennt (16) Affinitéitschromatographie (IMAC).
Wéi an der Figur 1 gewisen, enthalen béid Komplexer en RC mat dräi Ënnereenheeten (RC-L, RC-M an RC-H), deen vun enger LH1-Antenn ëmginn ass. D'2.80-A Struktur vum Komplex ouni Protein-W weist 16 αβ Heterodimeren, déi eng zougemaach LH1-Schleif bilden, déi RC komplett ëmgëtt, am weidere Sënn als RC-LH116 Komplex bezeechent. D'2.65Å Struktur vum protein-W-haltege Komplex huet en 14-Heterodimer LH1, deen duerch Protein-W ënnerbrach gëtt, am weidere Sënn als RC-LH114-W bezeechent.
(A an B) Uewerflächenrepresentatioun vun der Verbindung. (C an D) Gebonnen Pigmenter, déi a Staangen ausgedréckt ginn. (E an F) D'Komplexer, déi vun der zytoplasmatescher Uewerfläch observéiert ginn, hunn d'Peptiden an d'LH1-Ënnereenheeten, déi a Cartoons duergestallt sinn, a sinn am Auerzäresënn vun der Protein-W-Lach nummeréiert [am Aklang mat der Rba-Nummeréierung. sphaeroides-Komplex (13)]. Fir LH1-α ass d'Faarf vun der Protein-Ënnereenheet giel; fir LH1-β ass d'Faarf vun der Protein-Ënnereenheet blo; fir Protein-W ass d'Protein rout; fir RC-H ass et cyan; fir RC-L ass et orange; fir RC-M, magenta. Kofaktoren ginn duerch Staangen duergestallt, gréng representéiert BChl- a BPha-Molekülen, violett representéiert Carotinoiden, a giel representéiert UQ10-Molekülen. (G an H) Vergréissert Vue vun der Protein-W-Lach an der Äquivalentregioun vum RC-LH114-W-Komplex (G) an RC-LH116-Komplex (H). Kofaktoren ginn a Form vun enger Raumfëllung duergestallt, chelatéiert Chinon gëtt a Blo duergestallt. D'Protein-W-Lück ass duerch eng blo gestrichelt Linn an (G) markéiert, an déi kleng Lächer, wou Chinon/Chinolol um LH116-Rank diffundéiert, sinn duerch eng schwaarz gestrichelt Linn an (H) markéiert.
Figur 1 (A an B) weist den RC ëmginn vun oppenen oder zouenen Arrays vun LH1αβ Heterodimeren, déi all zwee BChl an ee Carotinoid binden (Figur 1, C an D). Fréier Studien hunn gewisen, datt Rps den LH1 Komplex ass. Am biosynthetesche Wee vum Spirulina Xanthin enthalen dës Spezies gemëschte Populatiounen vu Carotinoiden (17). Wéi och ëmmer, Spiropyrroxanthin ass den dominante Carotinoid a seng Dicht ass zefriddestellend. Dofir hu mir eis entscheet, Spiroxanthin op all LH1 Bindungsplazen ze modelléieren. D'Alpha- a Beta-Polypeptide sinn eenzel TMHs mat kuerzen Membran-äusseren Regiounen (Figur 1, A, B, E an F). Och wann d'Dicht vun 17 Reschter um C-Terminus net observéiert gouf, gouf den Alpha-Polypeptid a béide Komplexer vu Met1 op Ala46 gespalten. De β-Polypeptid gouf vu Gly4 op Tyr52 an RC-LH116 a vu Ser5 op Tyr52 an RC-LH114-W reduzéiert. Et gouf keng Dicht vun 3 oder 4 N-terminalen oder 13 C-terminalen Reschter observéiert (Figur S1). D'Massenspektrometrieanalyse vum gemëschte RC-LH1-Komplex, deen aus dem Wildtyp-Stamm preparéiert gouf, huet gewisen, datt déi fehlend Regioun d'Resultat vun der heterologer Spaltung vun dëse Peptiden war (Figur S1 an S2). D'N-terminal Formyléierung vun α-Met1 gouf och observéiert (f). D'Analyse huet gewisen, datt den α-Peptid aus de Reschter fMet1 bis Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 besteet, an de β-Peptid aus de Reschter Ser2 bis Ala53 besteet, wat a gudder Iwwereneestëmmung mat der Niddregtemperatur-EM-Dichtkaart ass.
D'Koordinatioun vun α-His29 an β-His36 mécht BChls vis-à-vis; all αβ Heterodimer setzt sech mat senge Noperen zesummen, fir eng oppe Schleif (RC-LH114-W) oder eng zougemaachte Schleif (RC-LH116) ronderëm den RC ze bilden. Den Exciton-gekoppelte Pigmentmatrix (Figur 1, C an D). Am Verglach mam 877 nm Band vum RC-LH114-W ass d'Absorptiounsroutverrécklung vum RC-LH116 bei 880 nm 3 nm (Figur 2A). Wéi och ëmmer, de kreesfërmegen Dichroismusspektrum ass bal d'selwecht (Figur 2B), wat drop hiweist, datt obwuel et en däitlechen Ënnerscheed tëscht oppene a zougemaachte Schleifen gëtt, d'lokal Ëmwelt vu BChls ganz ähnlech ass. D'Absorptiounsroutverrécklung kéint d'Resultat vun enger reduzéierter thermescher Bewegung an enger erhéichter Stabilitéit op der zougemaachter Schleif sinn (18, 19), der Ännerung vun der Pigmentkopplung, déi duerch déi zougemaach Schleif verursaacht gëtt (20, 21), oder enger Kombinatioun vun dësen zwou Effekter (11).
(A) Ultraviolett/sichtbaart/no-infrarout Absorptiounsspektrum, deem seng Spëtze mat hire korrespondéierende Pigmenter markéiert sinn a normaliséiert op de BPh-Peak bei 775 nm. (B) Kreesfërmegt Dichroismusspektrum normaliséiert op BChl-Absorptioun bei 805 nm. (C an D) Ausgewielt ΔA-Spektre vun den zäitopgeléisten Absorptiounsspektre vum RC-LH114-W-Komplex (C) an dem RC-LH116-Komplex (D). Fir eng besser Vergläichbarkeet sinn all Spektre normaliséiert op ∆A vun −A bei 0,2 ps. (E) D'Oxidatiounsquote vu Cytochrom c2 no der Bestrahlung a Präsenz vu verschiddene Konzentratioune vun UQ2 (kuckt Figur S8 fir Rohdaten). (F) An Zellen, déi ënner Liicht mat gerénger, mëttlerer oder héijer Intensitéit (10, 30 oder 300 μMm-2 s-1) gewuess sinn, d'Protein W- an RC-L-Ënnereenheeten am gereinegten Komplex an de Verhältnes vun der getrennter Membran. Bestëmmt de Proteinniveau duerch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese an Immunoassay (kuckt Figur S9 fir Rohdaten). Bestëmmt de Verhältnis relativ zum gereinegten RC-LH114-W Komplex. Dat stöchiometrescht Verhältnis vun RC-L zum Protein-W vum Komplex ass 1:1.
D'BChlen op der Positioun 1 an der deforméierter αβ14-Schleif vum RC-LH114-W (Figur 1, A, C an E) si 6,8 Å méi no beim RC-Primärdonor (P) wéi déi gläichwäerteg BChlen am RC-LH116 (Figur 1, B, D an F, a Figur S3); awer d'transient Absorptiounskinetik vun den zwou Komplexe weist, datt fir RC-LH114-W an RC-LH116 d'Zäitkonstanten fir d'Transferzäit vun der Anregungsenergie vun LH1 op RC 40 ±4 an 44 ±3 ps sinn (Figur 2, C an D, Figur S4 an Tabelle S2). Et gëtt och keen signifikanten Ënnerscheed am elektroneschen Transfer bannent RC (Figur S5 an de verwandten Ergänzungstext). Mir verdächtegen, datt déi enk Korrespondenz vun der Energietransferzäit tëscht LH1 an RC-P op déi ähnlech Distanz, de Wénkel an déi ähnlech potenziell Energie vun de meeschte BChlen an den zwou LH1-Schleifen zréckzeféieren ass. Et schéngt, datt d'Erfuerschung vum LH1-Energiemuster fir déi minimal Distanz z'erreechen net méi séier ass wéi en direkten Energietransfer vu suboptimalen Plazen op RC. D'Open-Loop LH1-Loop am RC-LH114-W kann och ënner niddregen Temperaturbedingungen eng onbedeitend thermesch Bewegung fir d'Strukturanalyse maachen, an et gëtt eng méi laang αβ14-Ringkonformatioun bei Raumtemperatur vun der Pigmentéierungsdistanz vu βBChls op der Positioun vun RC 1.
Den RC-LH116 Komplex enthält 32 BChls an 16 Carotinoiden, a seng Gesamtuerdnung ass déiselwecht wéi déi, déi aus Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 Stamm (PDB ID 7C9R) (12) a gréngen Algen (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) kritt gëtt. No der Ausriichtung goufen nëmme kleng Ofwäichungen an de Positioune vun den αβ Heterodimeren observéiert, besonnesch 1-5, 15 an 16 (Figur S6). D'Präsenz vu Protein-W huet e wesentlechen Afloss op d'Struktur vun LH1. Seng dräi TMHs sinn duerch kuerz Schleifen verbonnen, mat dem N-Terminal op der Lumensäit vum Komplex an dem C-Terminal op der zytoplasmatescher Säit (Figuren 1A an 3, A bis D). Protein-W ass gréisstendeels hydrophob (Figur 3B), an TMH2 an TMH3 interagéiere mat LH1αβ-14 fir eng transmembran Uewerfläch ze bilden (Figur 3, B an E bis G). D'Grenzfläch besteet haaptsächlech aus Phe-, Leu- a Val-Reschter an der transmembraner Regioun. Dës Reschter si mat hydrophoben Aminosäuren a αβ-14 Pigmenter gestapelt. E puer polar Reschter droen och zur Interaktioun bäi, dorënner d'Waasserstoffbréck tëscht W-Thr68 a β-Trp42 op der Uewerfläch vun der komplexer Kavitéit (Figur 3, F a G). Op der Uewerfläch vum Zytoplasma läit Gln34 nieft der Ketogrupp vun αβ-14 Carotinoiden. Zousätzlech gouf den n-Dodecyl β-d-Maltosid (β-DDM) Molekül opgeléist, a säin hydrophobe Schwanz huet sech bis op d'Grenzfläch tëscht Protein-W an αβ-14 erstreckt, an de Lipidschwanz kéint sech am Kierper befannen. Mir hunn och gemierkt, datt d'C-terminal Opléisungsregiounen vum Protein W an RCH ganz no beienee leien, awer net am Kader vun der Bildung vu spezifeschen Interaktiounen (Figur 1, A an E). Et kéinten awer Interaktiounen an den ongeléisten C-terminalen Aminosaieren vun dësen zwou Proteinen optrieden, déi e Mechanismus fir d'Rekrutéierung vu Protein-W während der Assemblage vum RC-LH114-W Komplex kéinte bidden.
(A) Protein-W, dat an der Zeechnung op d'Grenzfläch mat LH1αβ14 weist, huet eng staaffërmeg Säitekette (rout), déi an engem Deel vum elektrostatesche Potentialdiagramm ugewise gëtt (transparent gro Uewerfläch mat engem Konturniveau vun 0,13). (B) Protein-W gëtt duerch eng hydrophob faarweg Uewerfläch duergestallt. Polar a gelueden Beräicher ginn a Cyan duergestallt, hydrophob Beräicher a Wäiss, a staark hydrophob Beräicher an Orange. (C an D) Protein-W gëtt an der Zeechnung duergestallt, seng Orientéierung ass déiselwecht wéi an (A) (C), an ëm 180° gedréit (D). Jee no Positioun an der Sequenz huelen déi z'ënnerscheedbar Reschter e Reeboufaarfschema un, wou den N-Terminal blo an den C-Terminal rout ass. (E) Protein-W an der selwechter Vue wéi an (A), an d'Reschter op der Grenzfläch vu Protein-W:LH1 ginn duerch Staafe mat ugehängte Markéierungen duergestallt. (F) Protein-W ass ëm 90° am Verhältnes zu (E) an LH1αβ14 an der Zeechnung an am Verhältnes zu den Grenzflächenreschter an der Balkenrepresentatioun gedréit. Déi iwwerhängend Reschter vum Beta-Polypeptid sinn markéiert. De Cofaktor gëtt als Balk gewisen, deen der Faarf vun der Figur 1 entsprécht, den ofgebauten β-DDM ass gro an de Sauerstoff ass rout. (G) D'Vue an (F) ass ëm 180° gedréit, mat de prominente Reschter vum markéierten Alpha-Polypeptid.
Protein-W ersetzt en αβ Heterodimer (de 15. an der Figur 1F), wouduerch d'Schleifenzoumaache verhënnert gëtt an déi éischt dräi αβ Heterodimerer gekippt ginn. Et gouf observéiert, datt de maximalen Inklinatiounswénkel vum éischten αβ-1 Heterodimer am Verhältnes zum Filmnormal 25° bis 29° war (Figur 1, A an E), deen duerch d'Inklinatioun vun 2° bis 8° vun αβ-1 am RC A sharp contrast-LH116 (Figur 1, B an F) geformt gouf. Den zweeten an drëtten Heterodimer sinn tëscht 12° bis 22° respektiv 5° bis 10° geneigt. Wéinst dem stereschen Hindernis vum RC enthält d'Inklinatioun vun αβ-1 net dat zweet Paar vun αβ (wat dem 16. αβ an der Figur 1F entsprécht), wouduerch eng kloer Lück am LH1-Rank entsteet (Figur 1, A an E). Wéinst dem Manktem un zwéi αβ-Heterodimeren, begleet vum Verloscht vu véier BChl an zwéi Carotinoiden, bindt kee vun de Carotinoiden un déi verdréint αβ-1-Ënnereenheet, wat zu engem LH114-W-Rank féiert, deen 13 vegetaresch Carotinoiden an 28 BChl enthält. D'Schätzunge vun der lokaler Opléisung vun den zwéi Komplexer an den αβ1 bis 7 Regiounen si méi niddreg wéi déi vum Rescht vun der LH1-Schleef, wat déi inherent Plastizitéit vun der LH1-Ënnereenheet nieft der RC QB-Plaz reflektéiere kéint (Figur 4).
D'Biller vum RC-LH114-W (A an B) an RC-LH116 (C an D) gi vun der selwechter Vue vun uewen/Säit (A an B) (A an C) an der Kavitéitsuewerfläch aus der Fig. 1 (B an D) gewisen. Déi faarweg Tasten sinn op der rietser Säit gewisen.
Deen eenzegen anere charakteristesche Kärkomplex mat engem stöchiometresche Verhältnis vun 1:14 ass den Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX Dimer (13). Wéi och ëmmer, Protein W a PufX hunn keng offensichtlech Homologie a beaflossen e wesentlechen Afloss op hir jeeweileg LH1 Strukturen. PufX ass en eenzegen TMH mat engem N-terminalen zytoplasmatesche Beräich, deen mat der zytoplasmatescher Säit vun der RC-H Ënnereenheet (13) op enger Positioun interagéiert, déi dem Rps. palustris LH116αβ-16 entsprécht. PufX erstellt e Kanal fir den Chinon/Chinolon Austausch tëscht RC-LH1 an dem Cytochrom bcl Komplex a ass an all Rba. sphaeroides Kärkomplex (13) präsent. Obwuel d'Monomer-Monomer Grenzfläch an Rba ass. Den Sphaeroides RC-LH1-PufX Dimer läit op der Bindungspositioun vum Protein W am RC-LH114-W, an d'Lach, déi duerch PufX a Protein-W induzéiert gëtt, ass op enger gläichwäerteger Positioun (Figur S7A). D'Lach am RC-LH114-W ass och mat dem hypothetesche Chinonkanal (8) vu Pseudomonas rosea LH1 ausgeriicht, deen duerch Peptiden geformt gëtt, déi net mam Protein W oder PufX verwandt sinn (Figur S7B). Zousätzlech ass de Chinonkanal am Blc. Den smaragdgréngen LH1, deen duerch den Ausschluss vun enger γ-Ënnereenheet (7) geformt gëtt, läit op enger ähnlecher Positioun (Figur S7C). Och wann et duerch verschidde Proteinen vermittelt gëtt, schéngt d'Erscheinung vun dëse Chinon/Chinolol-Kanäl an enger gemeinsamer Positioun am RC-LH1-Komplex e Beispill vun enger konvergenter Evolutioun ze sinn, wat drop hiweist, datt d'Lach, dat vum Protein W entstanen ass, als Chinonkanal kéint fungéieren.
D'Lück an der LH114-W-Schleif erlaabt d'Bildung vun enger kontinuéierlecher Membranregioun tëscht dem internen Raum vum RC-LH114-W-Komplex an der Groussmembran (Figur 1G), anstatt déi zwou Domänen duerch eng Proteinpore ze verbannen, wéi a Proteinen. Den RC-LH116-Komplex ass ähnlech wéi e zouenen Tch.-Nadel-ähnleche Komplex (22) (Figur 1H). Well d'Diffusioun vu Chinon duerch d'Membran méi séier ass wéi d'Diffusioun duerch de schmuele Proteinkanal, kann déi oppe LH114-W-Schleif e méi schnelle RC-Ëmsatz erlaben wéi déi zoue LH116-Schleif, an d'Diffusioun vu Chinon an den RC kann méi limitéiert sinn. Fir ze testen, ob Protein W d'Konversioun vu Chinonen duerch RC beaflosst, hu mir en Cytochrom-Oxidatiounsassay op enger bestëmmter Konzentratioun vun Ubiquinon 2 (UQ2) (en Analogon vum natierlechen UQ10 mat engem méi kuerzen Isopren-Schwanz) duerchgefouert (Figur 2E). Obwuel d'Präsenz vu chelatiséiertem Chinon déi genee Bestëmmung vun der scheinbarer Michaelis-Konstant behënnert (RC-LH114-W an RC-LH116 si fir 0,2±0,1μM respektiv 0,5±0,2μM gëeegent), ass déi maximal Rate vun RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) 28±5% méi grouss wéi déi vun RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Mir hunn ufanks geschat, datt Protein-W a ronn 10% vum Kärkomplex präsent ass (16); hei sinn d'Besetzungsraten vu Wuesstumszellen mat wéineg Liicht, mëttlerem Liicht a vill Liicht 15±0,6%, 11±1% an 0,9±0,5% respektiv (Figur 2F). E quantitative Verglach vun der Massenspektrometrie huet gewisen, datt d'Zousätzlech vun engem Histidin-Tag d'relativ Heefegkeet vu Protein-W am Verglach mat Wildtyp-Stämme net reduzéiert huet (P = 0,59), sou datt dës Niveauen keen Artefakt vu modifizéiertem Protein-W sinn (Figur S10). Wéi och ëmmer, dës niddreg Besetzung vu Protein-W am RC-LH1-Komplex kéint et e puer RCs erlaben, mat enger beschleunegter Geschwindegkeet ze flippen, wouduerch de méi luesen Chinon/Chinolon-Austausch am RC-LH116-Komplex reduzéiert gëtt. Mir hunn gemierkt, datt déi héich Liichtbesetzungsrate mat de rezenten Transkriptomikdaten net iwwereneestëmmt, wat drop hiweist, datt d'pufW-Genexpression ënner staarkem Liicht eropgeet (Figur S11) (23). Den Ënnerscheed tëscht der pufW-Transkriptioun an der Protein-W-Inkorporatioun an den RC-LH1-Komplex ass verwirrend a kéint déi komplex Reguléierung vum Protein reflektéieren.
Am RC-LH114-W sinn 6 Cardiolipin (CDL), 7 Phosphatidylcholin (POPC), 1 Phosphatidylglycerol (POPG) an 29 β-DDM-Moleküle zougewisen a modelléiert: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG an 12 βDDM. RC-LH116 (Figur 5, A an B). An dësen zwou Strukturen ass CDL bal op der zytoplasmatescher Säit vum Komplex lokaliséiert, während POPC, POPG a β-DDM meeschtens op der luminaler Säit lokaliséiert sinn. Zwee Lipid- an Detergentmoleküle goufen an der αβ-1 bis αβ-6 Regioun vum RC-LH114-W Komplex isoléiert (Figur 5A), a fënnef goufen an der gläichwäerteger Regioun vum RC-LH116 isoléiert (Figur 5B). Méi Lipiden, haaptsächlech CDL, goufen op der anerer Säit vum Komplex fonnt, déi tëscht RC an αβ-7 bis αβ-13 gesammelt waren (Figur 5, A an B). Aner strukturell opgeléist Lipiden an Detergentien sinn ausserhalb vum LH1-Rank lokaliséiert, a gutt opgeléist Acylketten erstrecken sech tëscht LH1-Ënnereenheeten, déi virleefeg als β-DDM an RC-LH114-W bezeechent sinn, an als β-DDM an RC definéiert sinn. Eng Mëschung aus β-DDM a POPC-LH116. Déi ähnlech Positioune vu chelatéierende Lipiden an Detergentien an eiser Struktur weisen drop hin, datt si physiologesch relevant Bindungsplazen sinn (Figur S12A). D'Positioune vun gläichwäertege Molekülen an Tch hunn och eng gutt Konsistenz. Gentle an Trv. De Stamm 970 RC-LH1s (Figur S12, B bis E) (9, 12) an d'Waasserstoffbindungsreschter vun der Lipidkopfgrupp hunn eng zimlech gutt Konservéierung an der Sequenzausriichtung gewisen (Figur S13), wat drop hiweist, datt bei konservéierte CDL, déi un RC (24) binden, dës Plazen am RC-LH1-Komplex konservéiert kënne sinn.
(A an B) RC-LH114-W (A) an RC-LH116 (B) Peptide ginn duerch Zeechentrickfilmer duergestallt, an d'Pigmenter ginn duerch Stäbchen duergestallt, andeems d'Faarfschema an der Figur 1 benotzt gëtt. Lipiden sinn a rout duergestallt, an Detergentien sinn a gro duergestallt. UQ, deen un RC QA- a QB-Plazen gebonnen ass, ass giel, während isoléiert UQ blo ass. (C an D) Déiselwecht Vue wéi (A) an (B), ouni Lipiden. (E bis G) Vergréissert Vue vu Q1(E), Q2(F) a Q3(G) aus RC-LH116, mat Säiteketten, déi sech géigesäiteg beaflossen. D'Waasserstoffbindunge ginn als schwaarz gestrichelt Linnen duergestallt.
An RC-LH116 ginn souwuel RC QA wéi och QB UQ, déi um Elektronentransfer am Ladungsseparatiounsprozess bedeelegt sinn, an hire Bindungsplazen ofgebaut. Wéi och ëmmer, an RC-LH114-W ass QB-Chinon net opgeléist ginn a gëtt hei ënnendrënner am Detail diskutéiert. Zousätzlech zu QA- a QB-Chinonen sinn zwou chelatiséiert UQ-Molekülen (tëscht dem RC- an LH1-Réng) an der RC-LH114-W Struktur no hire gutt opgeléiste Kappgruppen (a Q1 bzw. Q2) zougewisen. (Raum). Figur 5C). Zwee Isopren-Eenheeten sinn Q1 zougewisen, an d'Dichtkaart léist déi komplett 10 Isopren-Schwänz vun Q2 op. An der Struktur vun RC-LH116 goufen dräi chelatiséiert UQ10-Molekülen (Q1 bis Q3, Figur 5D) opgeléist, an all Molekülen hunn eng kloer Dicht am ganze Schwanz (Figur 5, D bis G). An den zwou Strukturen hunn d'Positioune vun de Chinon-Kappgruppen vun Q1 an Q2 eng exzellent Konsistenz (Figur S12F), an si interagéieren nëmme mat RC. Q1 läit um Agank vun der W-Lück vun RC-LH114-W (Figur 1G an 5, C, D an E), an Q2 läit no bei der QB-Bindungsplaz (Figur 5, C, D) an F). Déi konservéiert L-Trp143- an L-Trp269-Reschter leien ganz no bei Q1 an Q2 a bidden potenziell π-Stacking-Interaktiounen (Figur 5, E an F, a Figur S12). L-Gln88, 3,0 Å vum distalen Sauerstoff vun Q1 ewech, liwwert eng staark Waasserstoffbindung (Figur 5E); dëse Rescht ass an allen RCs konservéiert ausser der wäitster Bezéiung (Figur S13). L-Ser91 gëtt konservativ fir Thr an de meeschten aneren RCs ersat (Figur S13), ass 3,8 Ångström vum Methylsauerstoff vu Q1 ewech a kann schwaach Waasserstoffbindungen ubidden (Figur 5E). Q3 schéngt keng spezifesch Interaktioun ze hunn, awer ass an der hydrophober Regioun tëscht der RC-M Ënnereenheet an der LH1-α Ënnereenheet 5 bis 6 lokaliséiert (Figur 5, D an G). Q1, Q2 an Q3 oder no beienee cheléiert Chinonen goufen och an Tch. Gentle, Trv. Strain 970 a Blc opgeléist. D'Irisstruktur (9, 10, 12) weist op eng konservéiert Hëllefschinonbindungsplaz am RC-LH1 Komplex hin (Figur S12G). Déi fënnef zersetzt UQ'en am RC-LH116 stëmmen gutt mat de 5,8 ± 0,7 vun all Komplex iwwereneen, déi duerch Héichleistungsflëssegkeetschromatographie (HPLC) bestëmmt goufen, während déi dräi zersetzt UQ'en am RC-LH114-W méi niddreg si wéi . De gemoossene Wäert vun 6,2 ± 0,3 (Fig. S14) weist drop hin, datt et ongeléist UQ-Moleküle an der Struktur gëtt.
Déi pseudo-symmetresch L- an M-Polypeptide enthalen all fënnef TMHs a bilden en Heterodimer, deen een BChl-Dimer, zwee BChl-Monomeren, zwee Bakteriophage (BPh)-Monomeren an een Net-Häm-Eisen an een oder zwee UQ10-Moleküle kombinéiert. Duerch d'Präsenz vu Waasserstoffbindungen op der terminaler Ketongrupp an hir bekannt Akkumulatioun an Rps ginn Carotinoiden an der M-Ënnereenheet integréiert, déi cis-3,4-dehydroorhodopin genannt gëtt. Spezies (25). Den äusseren Membrandomän vum RC-H ass duerch en eenzegen TMH un d'Membran verankert. Déi allgemeng RC-Struktur ass ähnlech wéi déi dräi Ënnereenheeten RC vu verwandte Spezies (wéi Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). D'Makrozyklen vu BChl a BPh, de Carotinoid-Réckgrat an den Net-Häm-Eisen iwwerlappen sech am Opléisungsberäich vun dëse Strukturen, sou wéi d'UQ10-Kappgrupp um QA-Stand an de QB-Chinon um RC-LH116 (Figur S15).
D'Disponibilitéit vun zwou RC-Strukturen mat ënnerschiddleche QB-Besetzungsraten bitt eng nei Méiglechkeet fir déi konsequent Konformatiounsännerungen z'ënnersichen, déi mat der Bindung vu QB-Chinonen verbonne sinn. Am RC-LH116-Komplex ass QB-Chinon an der voll gebonnener "proximaler" Positioun (26) lokaliséiert, awer d'Trennung vun RC-LH114-W huet kee QB-Chinon. Et gëtt kee QB-Chinon am RC-LH114-W, wat iwwerraschend ass, well de Komplex aktiv ass, méi wéi den RC-LH116-Komplex mat strukturell opgeléiste QB-Chinon. Och wann déi zwee LH1-Réng ongeféier sechs Chinonen chelatéieren, sinn fënnef strukturell opgeléist am zouenen RC-LH116-Ring, während nëmmen dräi strukturell limitéiert sinn am oppene RC-LH114-W-Ring. Dës erhéicht strukturell Stéierung kéint de méi schnelle Ersatz vun RC-LH114-W QB-Plazen, eng méi séier Chinonkinetik am Komplex an eng erhéicht Wahrscheinlechkeet fir d'LH1-Schleef ze kräizen, reflektéieren. Mir mengen, datt de Manktem u UQ an der RC QB-Plaz vum RC-LH114-W d'Resultat vun engem méi komplexen a méi aktive Komplex kéint sinn, an datt d'QB-Plaz vum RC-LH114-W direkt am UQ-Ëmsaz agefruer gouf. Déi spezifesch Phas (den Agank zum QB-Stadium gouf zougemaach) reflektéiert d'Konformatioun vun dëser Aktivitéit.
Ouni QB ass déi begleedend Rotatioun vun L-Phe217 an eng Positioun, déi net mat der UQ10-Bindung kompatibel ass, well se eng raimlech Kollisioun mat der éischter Isopren-Eenheet vum Schwanz verursaacht (Figur 6A). Zousätzlech sinn déi offensichtlech Haaptkonformatiounsännerungen offensichtlech, besonnesch d'Helix de (kuerz Helix an der Schleif tëscht TMH D an E), wou L-Phe217 an d'QB-Bindungstasch verréckelt gëtt, an d'Rotatioun vun L-Tyr223 (Figur 6A), fir d'Waasserstoffbindung mam M-Asp45-Raster ze briechen an den Entrée vun der QB-Bindungsplaz zouzemaachen (Figur 6B). D'Helix de dréit sech un hirer Basis, d'Cα vun L-Ser209 gëtt ëm 0,33 Å verréckelt, während d'L-Val221Cα ëm 3,52 Å verréckelt gëtt. Et gëtt keng observéierbar Ännerungen an TMH D an E, déi an deenen zwou Strukturen iwwerlagert kënne ginn (Figur 6A). Souwäit mir wëssen, ass dëst déi éischt Struktur am natierlechen RC, déi d'QB-Plaz zoumaacht. E Verglach mat der kompletter (QB-gebonnener) Struktur weist, datt ier de Chinon reduzéiert gëtt, eng Konformatiounsännerung néideg ass, fir datt en an de Chinon erakënnt. L-Phe217 rotéiert fir eng π-Stacking-Interaktioun mat der Chinon-Kappgrupp ze bilden, an d'Helix verréckelt sech no bausse, wouduerch de Skelett vun L-Gly222 an d'Säitekette vun L-Tyr223 e Waasserstoffbindungsnetz mat enger stabiler Waasserstoffbindungsstruktur bilden (Figur 6, A an C).
(A) Iwwerlappend Karikatur vun engem Hologramm (L-Kette, orange/M-Kette, magenta) an enger Apo-Struktur (gro), an där d'Schlësselreschter a Form vun enger staaffërmeger Representatioun ugewise ginn. UQ10 gëtt duerch e giele Balken duergestallt. Déi gepunktete Linn weist d'Waasserstoffbindungen un, déi an der ganzer Struktur geformt ginn. (B an C) D'Uewerflächenrepresentatioun vum Apolipoprotein an der ganzer Rankstruktur, déi de Sauerstoff vun der Säitekette vun L-Phe217 a blo an L-Tyr223 a rout ervirhiewen. D'L-Ënnereenheet ass orange; d'M- an H-Ënnereenheete sinn net faarweg. (D an E) Apolipoprotein (D) a ganz (E) RC QB-Plazen [faarweg no (A)] an Thermophilus thermophilus PSII (gréng, blo mat plastischem Chinon; PDB ID: 3WU2) Ausriichtung (58).
Iwwerraschenderweis, obwuel verschidde Strukturen vun QB-defizienten RCs ouni LH1 verfügbar sinn, goufen d'Konformatiounsännerungen, déi an dëser Studie observéiert goufen, net virdru gemellt. Dozou gehéieren d'QB-Depletiounsstruktur vu Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) an Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), déi all bal d'selwecht sinn wéi hir allgemeng QB-Struktur. Eng genee Ënnersichung vum 3PRC huet gewisen, datt LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxid) Detergentmoleküle sech um Agank vun der QB-Positioun bannen, wat eng Ëmorganiséierung an eng zougemaach Konformatioun verhënnere kann. Och wann LDAO net op der selwechter Positioun an 1EYS oder 1OGV zersetzt, ginn dës RCs mat dem selwechten Detergent hiergestallt a kënnen dofir deeselwechten Effekt produzéieren. D'Kristallstruktur vun Rba. Sphaeroides RC, dat mat Cytochrom c2 kokristalliséiert gouf (PDB ID: 1L9B), schéngt och eng zougemaach QB-Plaz ze hunn. An dësem Fall awer huet déi N-terminal Regioun vum RC-M Polypeptid (déi mat der QB-Bindungsplaz iwwer d'H-Bindung vum Tyr-Rest op der Q-Helix interagéiert) eng onnatierlech Konformatioun un, an d'QB-Konformatiounsännerung gëtt net weider ënnersicht (30). Berouegend ass, datt mir dës Zort Deformatioun vum M Polypeptid an der RC-LH114-W Struktur net gesinn hunn, déi bal d'selwecht ass wéi déi N-terminal Regioun vum RC-LH116 RC. Et sollt och bemierkt ginn, datt no der Eradikatioun vun der Detergent-baséierter LH1-Antenn d'Apolipoprotein-RCs am PDB opgeléist goufen, wat déi intern Chinonpools a Lipiden an der Lück tëscht dem RC an der bannenzeger Uewerfläch vum ëmleiende LH1-Rank eliminéiert huet (31, 32). RC bleift funktionell, well et all Kofaktoren behält, ausser dem ofbaubare QB-Chinon, deen manner stabil ass a während dem Virbereedungsprozess dacks verluer geet (33). Zousätzlech ass bekannt, datt d'Ewechhuele vun LH1 an natierleche zyklische Lipiden aus RC en Impakt op Funktiounen hunn kann, wéi zum Beispill déi verkierzt Liewensdauer vum ladungsgetrennten P+QB-Zoustand (31, 34, 35). Dofir spekuléiere mir, datt d'Existenz vum lokalen LH1-Rank ronderëm den RC déi "zougemaach" QB-Plaz erhalen kéint, an doduerch déi lokal Ëmwelt no beim QB erhalen kéint.
Obwuel Apolipoprotein (ouni QB-Chinon) an déi komplett Struktur nëmmen zwou Momentaufnahme vum Ëmsaz vun der QB-Plaz duerstellen, anstatt eng Serie vun Eventer, gëtt et Hiweiser datt d'Bindung gegated ka ginn fir d'Neibindung duerch Hydrochinon ze verhënneren fir d'Substratinhibitioun ze hemmen. D'Interaktioun vu Chinolol a Chinon no bei der QB-Plaz vum Apolipoprotein kann ënnerschiddlech sinn, wat zu senger Ofleenung duerch RC féiert. Et gëtt laang proposéiert datt Konformatiounsännerungen eng Roll bei der Bindung a Reduktioun vu Chinonen spillen. D'Fäegkeet vu gefruerenen RCs fir Chinonen no der Däischteradaptatioun ze reduzéieren ass beeinträchtigt (36); Röntgenkristallographie weist datt dëse Schued doduerch verursaacht gëtt datt QB-Chinonen an enger "distaler" Konformatioun ongeféier 4,5 Å vun der aktiver proximaler Positioun agespaart sinn (26, 37). Mir proposéieren datt dës distal Bindungskonformatioun eng Momentaufnahme vum Zwëschenzoustand tëscht Apolipoprotein an der kompletter Ringstruktur ass, déi op der initialer Interaktioun mat Chinon an der Ouverture vun der QB-Plaz follegt.
Den Typ II RC, deen am PSII-Komplex vu bestëmmte phototrophe Bakterien a Cyanobakterien, Algen a Planzen fonnt gëtt, huet eng strukturell a funktionell Erhaalung (38). Déi strukturell Ausriichtung, déi an der Figur 6 (D an E) gewisen ass, ënnersträicht d'Ähnlechkeet tëscht PSII RCs an der QB-Plaz vum bakteriellen RC-Komplex. Dëse Verglach ass zënter laangem e Modell fir d'Studie vun den enk verwandte Systemer vun der Chinonbindung a -reduktioun. Fréier Publikatiounen hunn drop higewisen, datt Konformatiounsännerunge mat enger PSII-Reduktioun vu Chinonen begleet ginn (39, 40). Dofir, wann een d'evolutiv Erhaalung vun RC berécksiichtegt, kéint dëse virdru net observéierte Bindungsmechanismus, wann een d'evolutiv Erhaalung vun RC berécksiichtegt, och op d'QB-Plaz vun PSII RC a sauerstoffräiche phototrophe Planzen uwendbar sinn.
Rps ΔpufW (onmarkéiert pufW-Deletioun) a PufW-His (C-terminal 10x His-markéiert Protein-W expriméiert vum natierleche pufW-Locus) Stämm. palustris CGA009 gouf an eiser viregter Aarbecht (16) beschriwwen. Dës Stämm an den isogene Wildtyp-Elteren goufen aus dem Tiefkühler gewonnen andeems eng kleng Zuel vun Zellen op PYE (jee 5 g Liter -1) (gelagert an LB bei -80 °C, mat 50% (w/v) Glycerol) Protein, Hefextrakt a Succinat) Agar [1,5% (w/v)] Plack gestreift goufen. D'Plack gouf iwwer Nuecht am Däischteren bei Raumtemperatur ënner anaerobe Konditiounen inkubéiert an duerno mat wäissem Liicht (~50 μmolm-2 s-1) beliicht, dat vun OSRAM 116-W Halogenbirnen (RS Components, UK) fir 3 bis 5 Deeg geliwwert gouf, bis eng eenzeg Kolonie opgetaucht ass. Eng eenzeg Kolonie gouf benotzt fir 10 ml M22+ Medium (41) ergänzt mat 0,1% (w/v) Casaminosäuren (weiderhin als M22 bezeechent) ze inokuléieren. D'Kultur gouf ënner Sauerstoffarme Konditiounen am Däischteren bei 34°C mat Schüttelen bei 180 rpm fir 48 Stonnen ugebaut, an duerno goufen 70 ml vun der Kultur ënner de selwechte Konditioune fir 24 Stonnen inokuléiert. Eng semi-aerob Kultur mat engem Volumen vun 1 ml gëtt benotzt fir 30 ml M22 Medium an enger 30 ml Universal-Schraufverschluss-transparenter Glasfläsch ze inokuléieren an 48 Stonnen mat Agitatioun (~50μmolm-2 s-1) mat engem sterile Magnéitkraaft-Rührstab bestraalt ze ginn. Duerno goufen 30 ml vun der Kultur mat ongeféier 1 Liter Kultur ënner de selwechte Konditioune inokuléiert, déi dann benotzt gouf fir ongeféier 9 Liter Kultur ze inokuléieren, déi bei ~200 μmolm-2 s-1 fir 72 Stonnen beliicht gouf. D'Zellen goufen duerch Zentrifugatioun bei 7132 RCF fir 30 Minutten geernt, an ~10 ml 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) resuspendéiert a bei -20°C gelagert, bis se gebraucht ginn.
Nom Optaue ginn e puer Kristaller vun Desoxyribonuklease I (Merck, UK), Lysozym (Merck, UK) an zwou Roche Holoenzymprotease-Inhibitor-Tabletten (Merck, UK) zu den resuspendéierten Zellen bäigefüügt. An enger franséischer Drockzell mat 20.000 psi (Aminco, USA) goufen d'Zellen 8 bis 12 Mol zerstéiert. Nodeems intakt Zellen an onléislech Iwwerreschter duerch Zentrifugatioun bei 18.500 RCF fir 15 Minutten bei 4°C ewechgeholl goufen, gouf d'Membran aus dem pigmentéierte Lysat duerch Zentrifugatioun bei 113.000 RCF fir 2 Stonnen bei 43.000°C ausgefällt. Déi löslech Fraktioun ewechgehäit an déi faarweg Membran an 100 bis 200 ml 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) resuspendéiert an homogeniséiert bis keng siichtbar Aggregater méi do sinn. Déi suspendéiert Membran gouf 1 Stonn am Däischteren bei 4°C mat sanftegem Réieren an 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) mat 2% (w/v) β-DDM inkubéiert. Duerno gouf bei 70°C zentrifugéiert, fir 150.000 RCF bei 4°C 1 Stonn opzeléisen, fir Reschter vun onléisleche Substanzen ze entfernen.
Déi solubiliséierend Membran vum ΔpufW-Stamm gouf op eng 50 ml DEAE Sepharose-Ionenaustauschkolonn mat dräi Kolonnenvolumen (CV) Bindungspuffer [20 mM Tris-HCl (pH 8,0) mat 0,03% (w/v) β-DDM] applizéiert. Wäscht d'Kolonn mat zwee CV-Bindungspufferen, an dann d'Kolonn mat zwee Bindungspufferen mat 50 mM NaCl. Den RC-LH116-Komplex gouf mat engem lineare Gradient vun 150 bis 300 mM NaCl (a Bindungspuffer) op 1,75 CV eluéiert, an de verbleiwene Bindungskomplex gouf mat engem Bindungspuffer mat 300 mM NaCl op 0,5 CV eluéiert. Sammelt den Absorptiounsspektrum tëscht 250 an 1000 nm, behält d'Fraktioun mat engem Absorptiounsverhältnis (A880/A280) méi grouss wéi 1 bei 880 bis 280 nm, verdënnt se zweemol am Bindungspuffer a benotzt déiselwecht Prozedur nach eng Kéier op der DEAE-Sail bei der Reinigung. Verdënnt d'Fraktiounen mat A880/A280-Verhältnisser méi héich wéi 1,7 an A880/A805-Verhältnisser méi héich wéi 3,0, féiert déi drëtt Ronn vum Ionenaustausch duerch a behält d'Fraktiounen mat A880/A280-Verhältnisser méi héich wéi 2,2 an A880/A805-Verhältnisser méi héich wéi 5,0. De partiell gereinegte Komplex gouf op ~2 ml an engem Amicon 100.000 Molekulargewiicht-Cut-off (MWCO) Zentrifugalfilter (Merck, UK) konzentréiert an op eng Superdex 200 16/600 Gréisstenausgrenzungskolonn (GE Healthcare, US) mat 200 mM NaCl-Puffer gelueden, an duerno am selwechte Puffer bei 1,5 CV eluéiert. Sammelt d'Absorptiounsspektre vun der Gréisstenausgrenzungsfraktioun a konzentréiert d'Absorptiounsspektre mat A880/A280-Verhältnisser iwwer 2,4 an A880/A805-Verhältnisser iwwer 5,8 bis 100 A880, a benotzt se direkt fir d'Virbereedung oder d'Lagerung vum Kryo-TEM-Gitter. Bis néideg halen. Bei -80°C halen.
Déi solubiliséierend Membran vum PufW-His-Stamm gouf op eng 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose-Sail (20 mM Tris-HCl (pH 8,0) mat 200 mM NaCl an 0,03% (w/w)) an IMAC-Puffer (GE Healthcare) applizéiert. (v) β-DDM]. D'Sail gouf mat fënnef CVs IMAC-Puffer an duerno mat fënnef CVs IMAC-Puffer mat 10 mM Histidin gewäsch. De Kärkomplex gouf mat fënnef IMAC-Puffer mat 100 mM Histidin aus der Sail eluéiert. D'Fraktioun, déi de RC-LH114-W-Komplex enthält, gëtt op ~10 ml an engem Rührbehälter mat engem Amicon 100.000 MWCO-Filter (Merck, UK) konzentréiert, 20-mol mat Bindungspuffer verdënnt an dann zu 25 ml bäigefüügt. An der DEAE Sepharose-Sail ginn am Viraus véier CVs, déi un de Puffer gebonnen sinn, benotzt. Wäscht d'Kolonn mat véier CV-Bindungspuffer, elutéiert dann de Komplex op aacht CVen op engem lineare Gradient vun 0 bis 100 mM NaCl (a Bindungspuffer), an déi reschtlech véier CVen enthalen 100 mM Bindungspuffer. Déi reschtlech Komplexer, déi op Natriumchlorid a Kombinatioun mat dem A880/A280-Verhältnis méi héich wéi 2,4 an dem A880/A805-Verhältnis méi héich wéi 4,6 Fraktiounen eluéiert goufen, goufen op ~2 ml an engem Amicon 100.000 MWCO Zentrifugalfilter konzentréiert a mat 1,5 CV IMAC am Viraus Puffer-equilibréierter Superdex 200 16/600 Gréisstenausgrenzungskolonn gefëllt an dann am selwechte Puffer iwwer 1,5 CV eluéiert. Sammelt d'Absorptiounsspektre vun de Gréisst-Ausgrenzungsfraktiounen a konzentréiert d'Absorptiounsspektre mat A880/A280-Verhältnisser iwwer 2,1 an A880/A805-Verhältnisser iwwer 4,6 bis 100 A880, déi direkt fir d'Virbereedung vum gefruerenen TEM-Gitter benotzt oder bei -80°C gelagert ginn, bis se gebraucht ginn.
E Leica EM GP Tauchgefrierschrank gouf benotzt fir TEM-Gitter bei niddreger Temperatur ze preparéieren. De Komplex gouf an IMAC-Puffer op A880 vun 50 verdënnt, an duerno goufen 5μl op en nei glühend entlueden QUANTIFOIL 1.2/1.3 Kuelestoffbeschichtete Kupfernetz (Agar Scientific, UK) gelueden. Inkubéiert de Gitter bei 20°C an 60% relativer Loftfiichtegkeet fir 30 Sekonnen, da loosst en 3 Sekonnen dréchnen an ofkillt dann a flëssegem Ethan bei -176°C.
D'Donnéeë vum RC-LH114-W Komplex goufen um eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) mat engem Titan Krios Mikroskop opgeholl, deen mat enger Beschleunigungsspannung vun 300 kV funktionéiert, mat enger nominaler Vergréisserung vun 130.000× an enger Energie vun - Wielt eng Lück vun 20 eV. E Gatan 968 GIF Quantum mat K2 Peak Detektor gouf benotzt fir Biller am Zählmodus opzehuelen fir Daten ze sammelen. Déi kalibréiert Pixelgréisst ass 1,048 Å, an d'Dosisrate ass 3,83 e-Å-2s-1. De Film gouf an 11 Sekonnen gesammelt an an 40 Deeler opgedeelt. Benotzt déi mat Kuelestoff beschichtete Fläch fir de Mikroskop nei ze fokusséieren, an dann dräi Filmer pro Lach sammelen. Am Ganzen goufen 3130 Filmer gesammelt, mat Defokusswäerter tëscht -1 an -3 μm.
D'Donnéeë fir den RC-LH116 Komplex goufen mam selwechte Mikroskop am Asterbury Biostructure Laboratory (University of Leeds, UK) gesammelt. D'Donnéeë goufen am Zählmodus mat enger Vergréisserung vun 130 k gesammelt, an d'Pixelgréisst gouf op 1,065 Å mat enger Dosis vu 4,6 e-Å-2s-1 kalibréiert. De Film gouf an 12 Sekonnen opgeholl an a 48 Deeler opgedeelt. Am Ganzen goufen 3359 Filmer gesammelt, mat Defokuswäerter tëscht -1 an -3 μm.
All Datenveraarbechtung gëtt an der Relion 3.0 Pipeline (42) duerchgefouert. Benotzt Motioncorr 2 (43) fir d'Stralbewegung duerch Dosisgewichtung ze korrigéieren, an dann benotzt CTFFIND 4.1 (44) fir de CTF (Kontrasttransferfunktioun) Parameter ze bestëmmen. Typesch Photomikroskopien no dësen initialen Veraarbechtungsstufen sinn an der Figur 2. S16 gewisen. Déi automatesch Auswielschabloun gëtt generéiert andeems ongeféier 250 Pixel vun 1000 Partikelen an engem 250-Pixel Frame manuell ausgewielt ginn an ouni Referenz zweedimensional (2D) Klassifikatioun, wouduerch déi Klassifikatiounen ofgeleent ginn, déi d'Prouvekontaminatioun erfëllen oder keng erkennbar Charakteristiken hunn. Duerno gouf eng automatesch Auswiel op all de Mikroskopien duerchgefouert, an den RC-LH114-W war 849.359 Partikelen, an de RC-LH116 Komplex war 476.547 Partikelen. All ausgewielte Partikelen hunn zwou Ronnen vun net-referenzéierter 2D-Klassifikatioun ënnerworf, an no all Laf ginn d'Partikelen, déi dem Kuelestoffberäich, der Proufkontaminatioun, keng offensichtlech Charakteristiken oder staark iwwerlappend Partikelen entspriechen, refuséiert, wat zu 772.033 (90,9%) an 359.678 (75,5%) resultéiert. D'Partikelen ginn fir d'3D-Klassifikatioun vum RC-LH114-W an RC-LH116 benotzt. Dat initialt 3D-Referenzmodell gouf mat der stochastescher Gradientenofstigsmethod generéiert. Mat dem initialen Modell als Referenz ginn déi ausgewielte Partikelen a véier Kategorien am 3D klasséiert. Mat dem Modell an dëser Kategorie als Referenz gëtt eng 3D-Verfeinerung op de Partikelen an der gréisster Kategorie duerchgefouert, dann den initialen 15Å Tiefpassfilter benotzt fir de Léisungsmëttelberäich ofzedecken, 6 Pixel mëll Kanten derbäisetzen, an d'Pixel noveraarbechten fir d'Gatan K2 Peak Modulatiounstransferfunktioun vum ieweschten Detektor ze korrigéieren. Fir den RC-LH114-W Datesaz gouf dëst initialt Modell modifizéiert andeems déi staark Dicht un de Kanten vun der Mask ewechgeholl gouf (vun der Kärkomplexdicht an der UCSF Chimera getrennt). Déi resultéierend Modeller (d'Opléisunge vum RC-LH114-W an RC-LH116 sinn 3,91 respektiv 4,16 Å) ginn als Referenz fir déi zweet Ronn vun der 3D Klassifikatioun benotzt. Déi benotzt Partikelen sinn an déi initial 3D Klass gruppéiert a weisen keng staark Korrelatioun mat der Noperschaft. Iwwerlappung oder Mangel u offensichtleche strukturellen Eegeschaften. No der zweeter Ronn vun der 3D Klassifikatioun gouf d'Kategorie mat der héchster Opléisung ausgewielt [Fir RC-LH114-W ass eng Kategorie 377.703 Partikelen (44,5%), fir RC-LH116 gëtt et zwou Kategorien, am Ganzen 260.752 Partikelen (54,7%), wou se nëmmen d'selwecht sinn, wa se no der initialer Rotatioun mat engem klenge Ënnerscheed ausgeriicht sinn]. Déi ausgewielte Partikelen ginn an enger 400-Pixel-Box nei extrahéiert a mat 3D-Raffinéierung verfeinert. D'Léisungsmëttelmask gëtt mat dem initialen 15Å-Tiefpassfilter, der 3-Pixel-Map-Expansioun an der 3-Pixel-Softmask generéiert. Mat der CTF-Raffinéierung pro Partikel, der Bewegungskorrektur pro Partikel an der zweeter Ronn vun der CTF-Raffinéierung pro Partikel ginn no all Schrëtt 3D-Raffinéierung, Léisungsmëttelmaskéierung a Postveraarbechtung duerchgefouert, fir déi resultéierend Textur weider ze verfeineren. Mat dem FSC-Grenzwert (Fourier Shell Correlation Coefficient) vun 0,143 sinn d'Opléisunge vun de finale Modeller vum RC-LH114-W an RC-LH116 2,65 respektiv 2,80 Å. D'FSC-Kurve vum finale Modell gëtt an der Figur 2 gewisen. S17.
All Proteinsequenze sinn vun UniProtKB erofgelueden: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) gouf benotzt fir en Homologiemodell vun RC ze konstruéieren, deen d'Proteinsequenze vun RC-L, RC-M an RC-H an d'Kristallstruktur vun Rba enthält. sphaeroides RC gouf als Schabloun benotzt (PDB ID: 5LSE) (46). Benotzt den "fit map" Tool an UCSF Chimera fir dat generéiert Modell un d'Kaart unzepassen (47), verbessert d'Proteinstruktur, a benotzt de Cofaktor [4×BChl a (Monomerbibliothéiksreschtnumm = BCL), 2×BPh a (BPH), eng oder zwou Aarte vun UQ10 (U10), een Non-Häm-Eisen (Fe) an een 3,4-Dihydrohexacarbonylcholin (QAK)] fir Coot (48) derbäizesetzen. Well QAK net an der Monomerbibliothéik verfügbar ass, gouf en mat dem eLBOW Tool a PHENIX (49) parametriséiert.
Duerno gouf d'LH1-Ënnereenheet konstruéiert. Ufanks gouf den automateschen Konstruktiounstool am PHENIX (49) benotzt fir automatesch en Deel vun der LH1-Sequenz ze konstruéieren andeems d'Kaart an d'LH1-α- an LH1-β-Proteinsequenzen als Input benotzt goufen. Wielt déi komplettst LH1-Ënnereenheet aus, extrahéiert se a lued se a Coot, füügt manuell déi fehlend Sequenz derbäi a verfeinert manuell déi ganz Struktur ier Dir zwee BCls a (BCL) an e Spirilloxanthin (CRT) derbäisetzt [no der jeweileger Rps D'Dicht vum LH1-Komplex an dem bekannte Carotinoidinhalt. Aart (17)]. Kopéiert déi komplett LH1-Ënnereenheet a benotzt den UCSF Chimera "Docking Map Tool" fir den ugrenzenden net-modelléierte Beräich vun der LH1-Dicht anzedocken, an dann a Coot ze verfeineren; widderhuelt de Prozess bis all LH1-Ënnereenheeten modelléiert sinn. Fir d'RC-LH114-W Struktur, andeems d'net zougewise Dicht am Coot extrahéiert gëtt, gëtt d'Protein vun de verbleiwenen Net-Protein Komponenten an der USCF Chimera Kaart segmentéiert an den Autobuild Tool gëtt benotzt fir den initialen Modell an déi verbleiwen Ënnereenheeten (Protein-W) ze etabléieren. Modelléierung. A PHENIX (49). Füügt all fehlend Sequenzen zum resultéierende Modell am Coot (48) bäi, an dann verfeinert manuell déi ganz Ënnereenheet. Déi verbleiwen net zougewise Dicht passt op d'Kombinatioun vu Lipiden (PDB Monomer Bibliothéik ID vun CDL = CDL, POPC = 6PL a POPG = PGT), β-DDM Detergent (LMT) an UQ10 Moleküllen (U10). Benotzt PHENIX Optimiséierung (49) a manuell Optimiséierung am Coot (48) fir dat komplett initial Modell ze perfektionéieren bis d'Modellstatistik an d'visuell Qualitéit vun der Upassung net weider verbessert kënne ginn. Schlussendlech benotzt LocScale (50) fir déi lokal Kaart ze schärfen, an da féiert Dir e puer aner Zyklen vun der Modelléierung vun der net zougewise Dicht an automatesch an manuell Optimiséierung duerch.
Déi jeeweileg Peptiden, Kofaktoren an aner Lipiden a Chinonen, déi an hire jeeweilegen Dichten ugedockt sinn, sinn an de Figuren 1 an 2, S18 bis S23, gewisen. Déi statistesch Informatioun vum Schlussmodell ass an der Tabell S1 gewisen.
Wann net anescht uginn, goufen d'UV/Vis/NIR-Absorptiounsspektre mat engem Cary60 Spektrophotometer (Agilent, USA) an 1 nm-Intervalle vun 250 nm bis 1000 nm an enger Integratiounszäit vun 0,1 Sekonnen opgeholl.
Verdënnt d'Prouf an enger Quarzkuvette mat engem 2 mm Wee op A880 vun 1, a sammelt den Absorptiounsspektrum tëscht 400 an 1000 nm. Déi zirkulär dichroesch Spektre goufen op engem Jasco 810 Spektropolarimeter (Jasco, Japan) an 1 nm Intervalle tëscht 400 nm an 950 nm mat enger Scanrate vun 20 nm min-1 gesammelt.
De molare Extinktiounskoeffizient gëtt bestëmmt andeems de Kärkomplex op en A880 vun ongeféier 50 verdënnt gëtt. Verdënnt den 10μl Volumen a 990μl Bindungspuffer oder Methanol, a sammelt den Absorptiounsspektrum direkt fir den BChl-Degradatioun ze minimiséieren. Den BChl-Gehalt vun all Methanolprouf gouf duerch den Extinktiounskoeffizient bei 771 nm vun 54,8 mM-1 cm-1 berechent, an den Extinktiounskoeffizient gouf bestëmmt (51). Dividéiert déi gemoossen BChl-Konzentratioun duerch 32 (RC-LH114-W) oder 36 (RC-LH116) fir d'Kärkomplexkonzentratioun ze bestëmmen, déi dann benotzt gëtt fir den Absorptiounsspektrum vun der selwechter Prouf ze bestëmmen, déi am Puffer parallel gesammelt gouf. Dräi widderholl Miessunge goufen fir all Prouf gemaach, an déi duerchschnëttlech Absorptioun vum BChl Qy-Maximum gouf fir d'Berechnung benotzt. Den Extinktiounskoeffizient vum RC-LH114-W, gemooss bei 878 nm, ass 3280 ± 140 mM-1 cm-1, während den Extinktiounskoeffizient vum RC-LH116, gemooss bei 880 nm, 3800 ± 30 mM-1 cm-1 ass.
UQ10 gouf no der Method an (52) quantifizéiert. Kuerz gesot, gouf eng Réckphas-HPLC (RP-HPLC) mat dem Agilent 1200 HPLC-System duerchgefouert. Ongeféier 0,02 nmol RC-LH116 oder RC-LH114-W an 50μl 50:50 Methanol:Chloroform mat 0,02% (w/v) Eisenchlorid léisen, an dat virausgeglach Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm an 1 ml-1 min-1 bei 40°C an HPLC-Léisungsmëttel (80:20 Methanol:2-Propanol) op eng ×25 cm Kolonn injizéiert. Eng isokratesch Elutioun an engem HPLC-Léisungsmëttel gëtt 1 Stonn laang duerchgefouert, fir d'Absorptioun bei 275 nm (UQ10), 450 nm (Carotinoiden) an 780 nm (BChl) ze iwwerwaachen. De Peak am 275 nm Chromatogramm no 25,5 Minutten gouf integréiert, deen keng aner noweisbar Verbindungen enthält. Déi integréiert Fläch gëtt benotzt fir d'molar Quantitéit vun UQ10 ze berechnen, déi mat Bezuch op d'Kalibratiounskurve extrahéiert gouf, déi aus der Injektioun vu puren Standarden vun 0 bis 5,8 nmol berechent gouf (Figur S14). All Prouf gouf an dräi Widderspréch analyséiert, an de gemellten Feeler entsprécht der SD vum Duerchschnëtt.
Eng Léisung mat dem RC-LH1-Komplex mat enger maximaler Qy-Absorptioun vun 0,1 gouf mat 30 μM reduzéiertem Päerdshäerz-Cytochrom c2 (Merck, UK) an 0 bis 50 μMUQ2 (Merck, UK) preparéiert. Dräi 1-ml-Prouwe goufen bei all UQ2-Konzentratioun preparéiert an iwwer Nuecht am Däischteren bei 4°C inkubéiert, fir eng komplett Adaptatioun un d'Däischtert virun der Miessung ze garantéieren. D'Léisung gouf an en OLIS RSM1000 modulare Spektrophotometer gelueden, deen mat engem 300 nm Flam/500-Linngitter, 1,24 mm Entrée, 0,12 mm Mëtt an 0,6 mm Auslaafschlitzer ausgestatt war. E 600 nm laange Passfilter gëtt um Agank vum Prouf-Fotoröhrchen an dem Referenz-Photomultiplierröhrchen placéiert, fir d'Ureegungsliicht auszeschléissen. D'Absorptioun gouf bei 550 nm mat enger Integratiounszäit vun 0,15 s iwwerwaacht. D'Anregungsliicht gëtt vun der 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) iwwer e Glasfaserkabel mat 90% Intensitéit iwwer en DC2200 Controller (Thorlabs Ltd., UK) ausgestraalt an an engem Wénkel vun 90° un d'Liichtquell ausgestraalt. De Miessstral ass géint de Spigel geriicht, fir all Liicht zréckzeginn, dat net ufanks vun der Prouf absorbéiert gouf. Iwwerwaacht d'Absorptioun 10 Sekonnen virun der Beliichtungsstäerkt vu 50 Sekonnen. Duerno gouf d'Absorptioun weider 60 Sekonnen am Däischteren iwwerwaacht, fir ze bewäerten, a wéi engem Mooss Quinolol spontan Cytochrom c23+ reduzéiert (kuckt Figur S8 fir Rohdaten).
D'Donnéeë goufe veraarbecht andeems eng linear Ufanksquote bannent 0,5 bis 10 s ugepasst gouf (ofhängeg vun der UQ2-Konzentratioun) an d'Geschwindegkeete vun allen dräi Proben bei all UQ2-Konzentratioun gemittelt goufen. D'RC-LH1-Konzentratioun, déi duerch de jeeweilege Extinktiounskoeffizient berechent gouf, gouf benotzt fir d'Quote an d'katalytesch Effizienz ëmzewandelen, déi am Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) opgezeechent gouf, an un de Michaelis-Menten-Modell ugepasst gouf fir déi scheinbar Km- a Kcat-Wäerter ze bestëmmen.
Fir transient Absorptiounsmiessunge gouf d'RC-LH1-Prouf op ~2μM an IMAC-Puffer verdënnt, deen 50 mM Natriumascorbat (Merck, USA) an 0,4 mM Terbutin (Merck, USA) enthält. Ascorbinsäure gëtt als Afferelektronendonor benotzt, an tert-Butaclofen als QB-Inhibitor, fir sécherzestellen, datt den Haapt-RC-Donor während dem ganze Miessprozess reduzéiert (dat heescht net photooxidéiert) bleift. Ongeféier 3 ml Prouf ginn an eng speziell rotéierend Zell (ongeféier 0,1 m Duerchmiesser, 350 RPM) mat enger optescher Weelängt vun 2 mm bäigefüügt, fir sécherzestellen, datt d'Prouf am Laserwee genuch Zäit fir d'Adaptatioun un d'Däischtert tëscht den Anregungsimpulser huet. Benotzt ~100-fs Laserimpulser fir den Ti:Sapphire Lasersystem (Spectra Physics, USA) ze verstäerken, fir d'Prouf bei 880 nm mat enger Widderhuelungsrate vun 1 kHz (20 nJ fir NIR oder 100 nJ fir Vis) unzeréieren. Virum Datesammelen, soll d'Prouf ongeféier 30 Minutten dem Anregungsliicht ausgesat ginn. D'Beliichtung féiert zu enger Inaktivéierung vum QA (méiglecherweis eng oder zweemol Reduktioun vum QA). Awer notéiert datt dëse Prozess reversibel ass, well no enger laanger Period vun der Däischteradaptatioun d'RC lues a lues op d'QA-Aktivitéit zréckkënnt. En Helios-Spektrometer (Ultrafast Systems, USA) gouf benotzt fir transient Spektren mat enger Verzögerungszäit vun -10 bis 7000 ps ze moossen. Benotzt d'Surface Xplorer Software (Ultrafast Systems, USA) fir d'Datensätz ze trennen, dann ze fusionéieren a standardiséieren. Benotzt de CarpetView Softwarepaket (Light Conversion Ltd., Litauen) fir de kombinéierten Datensaz ze benotzen fir Differenzialspektren am Zesummenhang mam Zerfall ze kréien, oder benotzt eng Funktioun déi verschidde Exponenten mat der Instrumentäntwert konvolvéiert fir d'Eenzelwellelängtespektralentwécklung an Origin (OriginLab, USA) unzepassen.
Wéi uewe scho gesot (53), gouf e photosynthetesche Film mat engem LH1-Komplex preparéiert, deen souwuel RC wéi och peripher LH2-Antenn feelt. D'Membran gouf a 20 mM Tris (pH 8,0) verdënnt an duerno an eng Quarzkuvette mat engem 2 mm optesche Wee gelueden. E 30nJ Laserpuls gouf benotzt fir d'Prouf bei 540 nm mat enger Verzögerungszäit vun -10 bis 7000 ps unzeréieren. Veraarbecht den Datensatz wéi fir d'Rps. pal-Prouf beschriwwen.
D'Membran gouf duerch Zentrifugatioun bei 150.000 RCF fir 2 Stonnen bei 4°C pelletéiert, an duerno gouf hir Absorbanz bei 880 nm an 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) an 200 mM NaCl resuspendéiert. Léist d'Membran op andeems se 1 Stonn laang am Däischteren bei 4°C lues a 2% (w/v) β-DDM réiert gouf. D'Prouf gouf an 100 mM Triethylammoniumkarbonat (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) op eng Proteinkonzentratioun vun 2,5 mg ml-1 verdënnt (Bio-Rad Analyse). Weider Veraarbechtung gouf no der virdru publizéierter Method (54) duerchgefouert, ugefaange mat der Verdënnung vun 50 μg Protein an insgesamt 50 μl TEAB mat 1% (w/v) Natriumlaurat (Merck, UK). Nom Ultraschall fir 60 Sekonnen gouf et mat 5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (Merck, UK) bei 37°C fir 30 Minutten reduzéiert. Fir d'S-Alkyléierung gëtt d'Prouf mat 10 mM Methyl-S-methylthiomethansulfonat (Merck, UK) inkubéiert an aus enger 200 mM Isopropanol-Stammléisung fir 10 Minutten bei Raumtemperatur bäigefüügt. Proteolytesch Verdauung gouf duerch d'Zousätz vun 2 μg Trypsin/Endoproteinase Lys-C-Mëschung (Promega UK) an d'Inkubatioun bei 37°C fir 3 Stonnen duerchgefouert. Den Laurat-Surfaktant gouf extrahéiert andeems 50 μl Ethylacetat an 10 μl 10% (v/v) LC-Grad Trifluoressigsäure (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) bäigefüügt goufen a fir 60 Sekonnen gevirbelt goufen. D'Phasentrennung gouf duerch Zentrifugatioun bei 15.700 RCF fir 5 Minutten gefördert. Geméiss dem Protokoll vum Hiersteller gouf eng C18 Spinkolonn (Thermo Fisher Scientific, UK) benotzt fir déi ënnescht Phase mat dem Peptid virsiichteg ofzesaugen an ze entsalzen. Nom Trocknen duerch Vakuumzentrifugatioun gouf d'Prouf an 0,5% TFA an 3% Acetonitril opgeléist, an 500 ng gouf duerch Nanoflow RP Chromatographie gekoppelt mat Massenspektrometrie mat de Systemparameteren analyséiert, déi virdru beschriwwe goufen.
Benotzt MaxQuant v.1.5.3.30 (56) fir d'Proteinidentifikatioun a Quantifizéierung fir no der Rps. palustris Proteomdatenbank ze sichen (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). D'Massenspektrometrie-Proteomikdaten goufen an der ProteomeXchange Alliance iwwer de PRIDE Partnerrepository (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ënner dem Datensatzidentifikator PXD020402 deposéiert.
Fir d'Analyse mat RPLC gekoppelt mat Elektrospray-Ioniséierungsmassenspektrometrie gouf den RC-LH1-Komplex aus Wildtyp-Rps preparéiert. Mat der virdru publizéierter Method (16) war d'Proteinkonzentratioun, déi a Palustris-Zellen produzéiert gouf, 2 mg ml-1 an 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl an 0,03% (w/v) β- (Bio-Rad Analyse)) DDM. Geméiss dem Protokoll vum Hiersteller gëtt en 2D-Reinigungskit (GE Healthcare, USA) benotzt fir 10 μg Protein duerch d'Ausfällungsmethod ze extrahéieren, an de Nidderschlag an 20 μl 60% (v/v) Ameensäure (FA), 20% (v/v) Acetonitril an 20% (v/v) Waasser opzeléisen. Fënnef Mikroliter goufen duerch RPLC (Dionex RSLC) gekoppelt mat Massenspektrometrie (Maxis UHR-TOF, Bruker) analyséiert. Benotzt eng MabPac 1,2 × 100 mm Kolonn (Thermo Fisher Scientific, UK) fir d'Trennung bei 60 °C an 100 μl min -1, mat engem Gradient vun 85% (v / v) Léisungsmëttel A [0,1% (v / v) FA an 0,02% (V/v) TFA wässerlech Léisung] bis 85% (v/v) Léisungsmëttel B [0,1% (v/v) FA an 0,02% (v/v) an 90% (v/v) Acetonitril TFA]. Mat enger Standard Elektrospray-Ioniséierungsquell a Standardparameter fir méi wéi 60 Minutten erzielt de Massespektrometer 100 bis 2750 m/z (Mass-zu-Ladung-Verhältnis). Mat Hëllef vum ExPASy Bioinformatik-Ressourceportal FindPept Tool (https://web.expasy.org/findpept/), kartéiert de Massespektrum op d'Ënnereenheete vum Komplex.
D'Zellen goufen 72 Stonnen ënner 100 ml NF-niddregem (10μMm-2 s-1), mëttlerem (30μMm-2 s-1) oder héijem (300μMm-2 s-1) Liicht ugebaut. M22 Medium (M22 Medium, an deem Ammoniumsulfat ewechgelooss ass an Natriumsuccinat duerch Natriumacetat ersat ass) an enger 100 ml Schraufverschlussfläsch (23). A fënnef 30-Sekonnen-Zyklen goufen 0,1 Mikrometer Glasperlen an engem Volumenverhältnis vun 1:1 agebaut, fir d'Zellen ze lyséieren, an 5 Minutten op Äis gekillt. Déi onléislech Matière, ongebrach Zellen a Glasperlen goufen duerch Zentrifugatioun bei 16.000 RCF fir 10 Minutten an enger Benchtop-Mikrozentrifuge ewechgeholl. D'Membran gouf an engem Ti 70.1 Rotor mat 100.000 RCF an 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) mat engem 40/15% (w/w) Saccharosegradient fir 10 Stonnen getrennt.
Wéi an eiser fréierer Aarbecht beschriwwen, Immunodetektioun vum His-Tag op PufW (16). Kuerz gesot, de gereinegte Kärkomplex (11,8 nM) oder d'Membran mat der selwechter Konzentratioun vun RC (bestëmmt duerch Oxidatioun, Subtraktioun vum reduzéierten Differenzspektrum an Upassung vun der Belaaschtung um gefierfte Gel) an 2x SDS-Ladepuffer (Merck, UK) gouf zweemol verdënnt. D'Proteine ​​goufen op engem Replika 12% Bis-Tris NuPage Gel (Thermo Fisher Scientific, UK) getrennt. E Gel gouf mat Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) gefierft fir d'RC-L-Ënnereenheet ze lueden an ze visualiséieren. D'Protein um zweete Gel gouf op eng Methanol-aktivéiert Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran (Thermo Fisher Scientific, UK) fir den Immunoassay transferéiert. D'PVDF-Membran gouf a 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 a 5% (w/v) Magermëllechpulver blockéiert an duerno 4 Stonnen mam Anti-His-Primärantikörper (an der Léisung vum Antikörperpuffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl an 0,05% (v/v) Tween-20] an 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) inkubéiert. Nodeem d'Membran 3-mol 5 Minutte laang am Antikörperpuffer gewäsch gouf, gouf se mat engem sekundären Antikörper géint Maus géint Mierrettichperoxidase (Sigma-Aldrich, UK) (verdënnt 1:10.000 am Antikörperpuffer). Fir d'Detektioun z'erméiglechen (5 Minutte no 3 Wäschungen am Antikörperpuffer) gouf de WESTAR ETA C 2.0 Chemilumineszenzsubstrat (Cyanagen, Italien) an den Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK) benotzt.
Andeems d'Intensitéitsverdeelung vun all gefierfte Gel- oder Immunoassay-Spuer gezeechent gëtt, d'Fläch ënner dem Peak integréiert gëtt an d'Intensitéitsverhältnis vun RC-L (gefierft Gel) a Protein-W (Immunoassay) berechent gëtt, gëtt d'Bild an ImageJ (57) veraarbecht. Dës Verhältnisser goufen a molare Verhältnisser ëmgewandelt, andeems ugeholl gouf, datt d'Verhältnis vun RC-L zu Protein-W an der purer RC-LH114-W-Prouf 1:1 war an de ganze Datesaz deementspriechend normaliséiert gouf.
Fir zousätzlech Materialien zu dësem Artikel, kuckt w.e.g. http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Dëst ass en Open-Access-Artikel, deen ënner de Bedéngunge vun der Creative Commons Attribution License verdeelt gëtt. Den Artikel erlaabt onbeschränkt Notzung, Verdeelung a Reproduktioun an all Medium, ënner der Bedingung, datt d'Originalwierk korrekt zitéiert gëtt.
Bemierkung: Mir froen Iech nëmmen Är E-Mailadress unzeginn, fir datt déi Persoun, déi Dir op der Säit recommandéiert, weess, datt Dir wëllt, datt si d'E-Mail gesäit an datt et kee Spam ass. Mir wäerten keng E-Mailadressen ophuelen.
Dës Fro gëtt benotzt fir ze testen ob Dir e Besucher sidd an automatesch Spam-Sendung ze verhënneren.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Déi héichopléisend Struktur vum Liichtfalle 1 Komplex am Reaktiounszentrum bitt nei Ablécker an d'Chinondynamik.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Déi héichopléisend Struktur vum Liichtfalle 1 Komplex am Reaktiounszentrum bitt nei Ablécker an d'Chinondynamik.
©2021 American Association for the Advancement of Science. all Rechter reservéiert. AAAS ass e Partner vun HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.