Aktuell *Aktuell Adress: Köln 50931, Däitschland, Köln Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
D'Neurodegeneratioun vu mitochondriale Krankheeten gëllt als irreversibel, well d'metabolesch Plastizitéit vun Neuronen limitéiert ass, awer den Effekt vun der mitochondrialer Dysfunktioun op d'Zellautonomie vum neuronalen Metabolismus am Kierper ass schlecht verstanen. Hei stelle mir dat zellspezifescht Proteom vu Purkinje-Neuronen mat progressivem OXPHOS-Mangel vir, verursaacht duerch eng gestéiert mitochondrial Fusiounsdynamik. Mir hunn festgestallt, datt mitochondrial Dysfunktioun eng déifgräifend Ännerung am Beräich vun der Proteomik ausgeléist huet, déi schlussendlech zu der sequenzieller Aktivéierung vu präzise metabolesche Programmer virum Zelltod gefouert huet. Onverhoffterweis hu mir déi offensichtlech Induktioun vu Pyruvatcarboxylase (PCx) an aner Anti-Aging-Enzymer festgestallt, déi d'Intermediären vum TCA-Zyklus ergänzen. D'Inhibitioun vu PCx huet den oxidativen Stress an d'Neurodegeneratioun verschäerft, wat drop hiweist, datt Atherosklerose e schützende Effekt an Neuronen huet, deenen OXPHOS feelt. D'Restauratioun vun der mitochondrialer Fusioun an terminal degeneréierten Neuronen dréit dës metabolesch Charakteristiken komplett ëm, wouduerch den Zelltod verhënnert gëtt. Eis Erkenntnisser identifizéieren virdru onbekannt Weeër, déi Widderstandsfäegkeet géint mitochondrial Dysfunktioun vermëttelen, a weisen datt d'Neurodegeneratioun och an de spéide Stadien vun der Krankheet ëmgedréit ka ginn.
Déi zentral Roll vun de Mitochondrien bei der Erhalen vun der neuronaler Energiemetabolismus gëtt duerch déi extensiv neurologesch Symptomer betount, déi mat mënschleche Mitochondrienerkrankungen verbonne sinn. Déi meescht vun dëse Krankheeten ginn duerch Genmutatiounen verursaacht, déi d'mitochondrial Genexpression reguléieren (1, 2) oder Genzerstéierung am Zesummenhang mat der mitochondrialer Dynamik, déi indirekt d'Stabilitéit vun der mitochondrialer DNA (mtDNA) beaflossen (3, 4). Aarbechten an Déiermodeller hunn gewisen, datt als Äntwert op mitochondrial Dysfunktioun an den Ëmgéigendgewebe konservativ metabolesch Weeër (5-7) aktivéiert kënne ginn, wat wichteg Informatioune fir e grëndlecht Verständnis vun der Pathogenese vun dëse komplexe Krankheeten liwwert. Am Géigesaz dozou ass eist Verständnis vun de metabolesche Verännerunge vu spezifeschen Zelltypen, déi duerch den allgemenge Versoen vun der mitochondrialer Adenosintriphosphat (ATP) Produktioun am Gehir verursaacht ginn, fundamental (8), wat d'Noutwennegkeet betount, therapeutesch Ziler z'identifizéieren, déi kënne benotzt ginn, fir Krankheeten ze vermeiden oder ze verhënneren. Neurodegeneratioun ze verhënneren (9). De Manktem un Informatioun ass d'Tatsaach, datt Nervenzellen allgemeng als ganz limitéiert metabolesch Flexibilitéit ugesi ginn am Verglach mat den Zelltypen vun den Ëmgéigendgewebe (10). Well dës Zellen eng zentral Roll bei der Koordinatioun vun der Versuergung mat Metabolitten un Neuronen spillen, fir d'synaptesch Iwwerdroung ze fërderen an op Verletzungen a Krankheeten ze reagéieren, ass d'Fäegkeet, den Zellmetabolismus un déi usprochsvoll Konditioune vum Gehirgewebe unzepassen, bal op Gliazellen limitéiert (11-14). Zousätzlech behënnert déi inherent zellulär Heterogenitéit vum Gehirgewebe d'Studie vu metabolesche Verännerungen, déi a spezifeschen neuronalen Ënnergruppen optrieden, gréisstendeels. Dofir ass wéineg iwwer déi genee zellulär a metabolesch Konsequenze vun der mitochondrialer Dysfunktioun an Neuronen bekannt.
Fir déi metabolesch Konsequenze vun der mitochondrialer Dysfusioun ze verstoen, hu mir Purkinje-Neuronen (PNs) a verschiddene Stadien vun der Neurodegeneratioun isoléiert, déi duerch d'Zerstéierung vun der mitochondrialer äusserer Membranfusioun (Mfn2) verursaacht ginn. Och wann Mfn2-Mutatiounen beim Mënsch mat enger Form vun ierflecher motorsensorescher Neuropathie verbonne sinn, bekannt als Charcot-Marie-Tooth Typ 2A (15), ass déi bedingt Zerstéierung vun Mfn2 bei Mais eng gutt unerkannt Method vun der Induktioun vun der Oxidatiounsphosphoryléierung (OXPHOS) Dysfunktioun. Déi verschidden neuronal Subtypen (16-19) an de resultéierende neurodegenerativen Phänotyp gi vu progressiven neurologesche Symptomer begleet, wéi Bewegungsstéierungen (18, 19) oder zerebellar Ataxie (16). Mat Hëllef vun enger Kombinatioun vu markéierterfräier quantitativer (LFQ) Proteomik, Metabolomik, Bildgebung a virologesche Methoden, weisen mir datt progressiv Neurodegeneratioun Pyruvatcarboxylase (PCx) an aner Faktoren, déi an der Arteriosklerose vu PNs in vivo involvéiert sinn, staark induzéiert. D'Expressioun vun Enzymen. Fir d'Relevanz vun dësem Befund ze verifizéieren, hu mir spezifesch d'Expressioun vu PCx a Mfn2-defizienten PNs erofreguléiert, a festgestallt, datt dës Operatioun den oxidativen Stress verschäerft an d'Neurodegeneratioun beschleunegt huet, wat beweist, datt Azoospermie Zelltod a metabolesch Adaptabilitéit verursaacht. Eng schwéier Expressioun vun MFN2 kann déi terminal degenerativ PN mat schwéierem OXPHOS-Mangel, massivem Konsum vu mitochondrialer DNA an engem anscheinend gebrachenen mitochondrialen Netzwierk komplett rette, wat weider ënnersträicht, datt dës Form vun Neurodegeneratioun sech souguer am fortgeschrattene Stadium vun der Krankheet virum Zelltod erhuele kann.
Fir d'Mitochondrien an Mfn2-Knockout-PNs ze visualiséieren, hu mir e Mausstamm benotzt, deen et Cre-ofhängege Mitochondrien erlaabt, d'Cre-Expressioun vum giele fluoreszente Protein (YFP) (mtYFP) (20) unzespriechen, an hunn d'mitochondrial Morphologie in vivo iwwerpréift. Mir hunn festgestallt, datt d'Zerstéierung vum Mfn2-Gen an PNs zu enger gradueller Deelung vum mitochondrialen Netzwierk féiert (Figur S1A), an déi fréist Ännerung gouf am Alter vun 3 Wochen festgestallt. Am Géigesaz dozou huet déi substantiell Degeneratioun vun der PN-Zellschicht, wéi se duerch de Verloscht vun der Calbindin-Immunofärbung bewisen ass, eréischt am Alter vun 12 Wochen ugefaangen (Figur 1, A an B). Den Zäitënnerscheed tëscht den fréisten Ännerungen an der mitochondrialen Morphologie an dem siichtbare Ufank vum neuronalen Doud huet eis dozou bruecht, déi metabolesch Ännerungen z'ënnersichen, déi duerch mitochondrial Dysfunktioun virum Zelltod ausgeléist ginn. Mir hunn eng Strategie op Basis vun der Fluoreszenz-aktivéierter Zellsortéierung (FACS) entwéckelt, fir YFP (YFP+)-expriméierend PN (Figur 1C) ze isoléieren, an a Kontrollmais (Mfn2+ / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), am weidere Sënn als CTRL bezeechent (Figur S1B). D'Optimiséierung vun der Gating-Strategie baséiert op der relativer Intensitéit vum YFP-Signal erlaabt eis, de YFP+ Kierper (YFPhigh) vu PNs aus Net-PNs (YFPneg) (Figur S1B) oder vermutleche fluoreszenten Axon/Dendritfragmenter (YFPlow; Figur S1D, lénks) ze purifizéieren, wat duerch e konfokale Mikroskop bestätegt gouf (Figur S1D, riets). Fir d'Identitéit vun der klasséierter Populatioun ze verifizéieren, hu mir LFQ Proteomik an duerno Haaptkomponentenanalyse duerchgefouert, a festgestallt, datt et eng kloer Trennung tëscht YFPhigh- an YFPneg-Zellen gëtt (Figur S1C). YFPhigh-Zellen hunn eng Netto-Anreicherung vu bekannte PN-Markéierer gewisen (z.B. Calb1, Pcp2, Grid2 an Itpr3) (21, 22), awer keng Anreicherung vu Proteinen, déi allgemeng an Neuronen oder aner Zelltypen expriméiert ginn (Figur 1D)). E Verglach tëscht Proben a klasséierte YFPhigh-Zellen, déi an onofhängege Experimenter gesammelt goufen, huet e Korrelatiounskoeffizient vun > 0,9 gewisen, wat eng gutt Reproduzéierbarkeet tëscht biologesche Replikater weist (Figur S1E). Zesummegefaasst hunn dës Donnéeën eise Plang fir akut an spezifesch Isolatioun vu machbarer PN validéiert. Well den L7-cre-Driversystem, deen benotzt gouf, eng Mosaik-Rekombinatioun an der éischter Woch no der Gebuert induzéiert (23), hu mir ugefaangen, Mais aus CTRL ze trennen an d'Neuronen bedingt ze sammelen (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre). Nodeems d'Rekombinatioun ofgeschloss ass, gëtt se am Alter vu 4 Wochen Mfn2cKO genannt. Als Endpunkt hu mir en Alter vun 8 Wochen gewielt, wou d'PN-Schicht intakt war, trotz der offensichtlecher mitochondrieller Fragmentéierung (Figur 1B a Figur S1A). Am Ganzen hu mir insgesamt 3013 Proteine ​​quantifizéiert, vun deenen ongeféier 22% op MitoCarta 2.0 Annotatiounen baséiert waren, déi um mitochondrialen Proteom als Mitochondrien baséieren (Figur 1E) (Figur 1E) (24). Déi differentiell Genexpressionsanalyse, déi an der 8. Woch duerchgefouert gouf, huet gewisen, datt nëmmen 10,5% vun alle Proteinen signifikant Ännerungen haten (Figur 1F a Figur S1F), vun deenen 195 Proteine ​​erofreguléiert an 120 Proteine ​​eropreguléiert waren (Figur 1F). Et ass derwäert ze bemierken, datt déi "innovativ Weeanalyse" vun dësem Datesaz weist, datt déi differenziell expriméiert Genen haaptsächlech zu engem limitéierten Set vu spezifesche metabolesche Weeër gehéieren (Figur 1G). Interessanterweis, obwuel d'Downreguléierung vu Weeër am Zesummenhang mat OXPHOS a Kalziumsignaléierung d'Induktioun vun enger mitochondrialer Dysfunktioun a fusionsdefizitäre PNs bestätegt, sinn aner Kategorien, déi haaptsächlech den Aminosäuremetabolismus betreffen, signifikant eropreguléiert, wat mam Metabolismus iwwereneestëmmt, deen a mitochondrialer PNs Dysfunktioun stattfënnt. D'Neiverdrahtung ass konsequent.
(A) Representativ konfokal Fotoe vu klenghirnen Schnëtter vu CTRL- a Mfn2cKO-Mais, déi de progressive Verloscht vu PNs (Calbindin, gro) weisen; d'Zellkäre goufen mat DAPI gegengefierft. (B) Quantifizéierung vun (A) (Een-Wee-Varianzanalyse, ***P<0,001; n = 4 bis 6 Kreesser vun dräi Mais). (C) Experimentellen Workflow. (D) Hëtzekaartverdeelung vu Markéierer spezifesch fir Purkinje (uewen) an aner Zelltypen (Mëtt). (E) Venn-Diagramm, dat d'Zuel vun de mitochondrialen Proteinen weist, déi an der klasséierter PN identifizéiert goufen. (F) Vulkandiagramm vun differentiell expriméierte Proteinen an Mfn2cKO-Neuronen no 8 Wochen (Signifikantkeetsgrenz vun 1,3). (G) D'Analyse vun der Kreativitéitswee weist déi fënnef wichtegst Up-Reguléierungs- (rout) an Down-Reguléierungs- (blo) Weeër an der Mfn2cKO PN, déi als 8 Wochen klasséiert ass. Den duerchschnëttlechen Expressiounsniveau vun all detektéiertem Protein gëtt gewisen. Grostufenhëtzekaart: ugepassten P-Wäert. ns, net wichteg.
Proteomikdaten hunn gewisen, datt d'Proteinexpressioun vun de Komplexen I, III an IV graduell erofgaangen ass. D'Komplexen I, III an IV hunn all essentiell mtDNA-kodéiert Ënnereenheeten enthale, während de Komplex II, deen nëmmen nuklear kodéiert war, praktesch net beaflosst gouf (Figur 2A a Figur S2A). Am Aklang mat de Proteomikresultater huet d'Immunhistochemie vun de cerebellare Gewëbeschnëtter gewisen, datt den MTCO1 (mitochondrial Cytochrom C Oxidase Ënnereenheet 1) Ënnereenheetsniveau vum Komplex IV an der PN graduell erofgaangen ass (Figur 2B). Déi mtDNA-kodéiert Ënnereenheet Mtatp8 gouf däitlech reduzéiert (Figur S2A), während de Steady-State-Niveau vun der nuklear kodéierter ATP-Synthase-Ënnereenheet onverännert bliwwen ass, wat mam bekannte stabile ATP-Synthase-Ënnerassembléierungskomplex F1 iwwereneestëmmt, wann d'mtDNA-Expressioun stabil ass. D'Bildung ass konsequent. Ënnerbriechung (7). D'Evaluatioun vum mtDNA-Niveau an den sortéierten Mfn2cKO PNs duerch Echtzäit-Polymerase-Kettenreaktioun (qPCR) huet de graduellen Réckgang vun der mtDNA-Kopiezuel bestätegt. Am Verglach mat der Kontrollgrupp goufen am Alter vun 8 Wochen nëmmen ongeféier 20% vum mtDNA-Niveau zréckbehalen (Figur 2C). Am Aklang mat dëse Resultater gouf d'konfokal Mikroskopie-Färbung vun Mfn2cKO PNs benotzt fir DNA ze detektéieren, wat den zäitofhängege Konsum vu mitochondrialen Nukleotiden weist (Figur 2D). Mir hunn festgestallt, datt nëmmen e puer Kandidaten, déi un der mitochondrieller Proteinofbau an der Stressreaktioun bedeelegt sinn, eropreguléiert waren, dorënner Lonp1, Afg3l2 a Clpx, an OXPHOS-Komplex-Assembléierungsfaktoren. Et goufen keng bedeitend Ännerungen an de Proteinniveauen, déi un der Apoptose bedeelegt sinn, festgestallt (Figur S2B). Ähnlech hu mir festgestallt, datt d'Mitochondrien an d'endoplasmatescht Retikulumkanäl, déi um Kalziumtransport bedeelegt sinn, nëmme kleng Ännerungen hunn (Figur S2C). Zousätzlech huet d'Evaluatioun vun Autophagie-verwandte Proteinen keng bedeitend Ännerungen festgestallt, wat mat der siichtbarer Induktioun vun Autophagosomen iwwereneestëmmt, déi in vivo duerch Immunhistochemie an Elektronemikroskopie observéiert gouf (Figur S3). Wéi och ëmmer, déi progressiv OXPHOS Dysfunktioun an PNs gëtt vun offensichtleche ultrastrukturelle mitochondriale Verännerungen begleet. Mitochondrial Cluster kënnen an de Zellkierper an dendritesche Beem vun Mfn2cKO PNs am Alter vu 5 an 8 Wochen gesi ginn, an d'bannenzeg Membranstruktur huet déifgräifend Verännerungen erlieft (Figur S4, A an B). Am Aklang mat dësen ultrastrukturelle Verännerungen an enger bedeitender Ofsenkung vun der mtDNA huet d'Analyse vun akuten zerebrale Kleinhirnscheiwen mat Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM) gewisen, datt de mitochondriale Membranpotenzial an Mfn2cKO PNs bedeitend reduzéiert war (Figur S4C).
(A) Zäitverlafanalyse vum Expressiounsniveau vum OXPHOS-Komplex. Betruecht nëmme Proteine ​​mat P<0,05 no 8 Wochen (Zwei-Weeër-ANOVA). Gepunktelt Linn: Keng Upassung am Verglach mat CTRL. (B) Lénks: E Beispill vun enger cerebellarer Sektioun, déi mat Anti-MTCO1-Antikörper markéiert ass (Skala-Staang, 20 μm). D'Fläch, déi vu Purkinje-Zellkierper besat ass, ass giel bedeckt. Riets: Quantifizéierung vun den MTCO1-Niveauen (Een-Weeër-Varianzanalyse; n = 7 bis 20 Zellen, analyséiert vun dräi Mais). (C) qPCR-Analyse vun der mtDNA-Kopiezuel am sortéierte PN (Een-Weeër-Varianzanalyse; n = 3 bis 7 Mais). (D) Lénks: E Beispill vun enger cerebellarer Scheif, déi mat engem Anti-DNA-Antikörper markéiert ass (Skala-Staang, 20 μm). D'Fläch, déi vu Purkinje-Zellkierper besat ass, ass giel bedeckt. Riets: Quantifizéierung vun mtDNA-Läsionen (Een-Weeër-Varianzanalyse; n = 5 bis 9 Zellen vun dräi Mais). (E) E Beispill vun engem akuten Zerebellumschnëtt, deen MitoYFP + Purkinje-Zellen (Pfeil) an enger Ganzzell-Patch-Clamp-Opnam weist. (F) Quantifizéierung vun der IV-Kurve. (G) Representativ Opname vun der depolariséierender Strouminjektioun a CTRL- an Mfn2cKO-Purkinje-Zellen. Uewe Spur: Den éischten Impuls, deen AP ausgeléist huet. Ënnescht Spur: Maximal AP-Frequenz. (H) Quantifizéierung vun postsynapteschen spontanen Inputen (sPSPs). Déi representativ Opnamspur a säi Zoom-Verhältnis sinn an (I) gewisen. Een-Wee-Varianzanalyse analyséiert n = 5 bis 20 Zellen vun dräi Mais. D'Donnéeë ginn als Mëttel ± SEM ausgedréckt; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. (J) Representativ Spure vu spontaner AP, déi mam perforéierte Patch-Clamp-Modus opgeholl goufen. Uewe Spur: Maximal AP-Frequenz. Ënnescht Spur: Zoom vun enger eenzeger AP. (K) Quantifizéier déi duerchschnëttlech an maximal AP-Frequenz no (J). Mann-Whitney-Test; n = 5 Zellen goufen vu véier Mais analyséiert. D'Donnéeë ginn als Moyenne ± SEM ausgedréckt; net wichteg.
Offensichtleche OXPHOS-Schued gouf beim 8 Wochen ale Mfn2cKO PN festgestallt, wat drop hiweist, datt déi physiologesch Funktioun vun den Neuronen eescht anormal ass. Dofir hu mir déi passiv elektresch Charakteristike vun OXPHOS-defizienten Neuronen no 4 bis 5 Wochen an no 7 bis 8 Wochen analyséiert, andeems mir Ganzzell-Patch-Clamp-Opzeechnunge vun akuten Zerebellumschnitter duerchgefouert hunn (Figur 2E). Onverhoffterweis waren dat duerchschnëttlecht Roumembranpotential an den Input-Resistenz vun den Mfn2cKO-Neuronen ähnlech wéi bei der Kontroll, obwuel et subtil Ënnerscheeder tëscht de Zellen gouf (Tabell 1). Ähnlech goufen am Alter vu 4 bis 5 Wochen keng bedeitend Ännerungen an der Stroum-Spannungs-Bezéiung (IV-Kurve) fonnt (Figur 2F). Wéi och ëmmer, keng Mfn2cKO-Neuronen vun 7 bis 8 Wochen hunn den IV-Regime (Hyperpolarisatiounsschratt) iwwerlieft, wat drop hiweist, datt et eng kloer Sensibilitéit fir den Hyperpolarisatiounspotential an dësem spéide Stadium gëtt. Am Géigesaz dozou ginn an Mfn2cKO Neuronen déi depolariséierend Stréim, déi repetitiv Aktiounspotenzial (AP) Entladungen verursaachen, gutt toleréiert, wat drop hiweist, datt hir allgemeng Entladungsmuster net signifikant vun deenen vun 8 Wochen ale Kontrollneuronen ënnerscheeden (Tabell 1 a Figur 2G). Ähnlech waren d'Frequenz an d'Amplitude vu spontane postsynaptesche Stréim (sPSCs) vergläichbar mat deenen vun der Kontrollgrupp, an d'Frequenz vun den Eventer ass vu 4 Wochen op 5 Wochen op 7 Wochen op 8 Wochen mat enger ähnlecher Erhéijung eropgaang (Figur 2, H an I). D'Period vun der synaptescher Reifung an PNs (25). Ähnlech Resultater goufen no perforéierte PNs Patches kritt. Dës Konfiguratioun verhënnert déi méiglech Kompensatioun vu zelluläre ATP-Defekter, wéi et bei enger ganzzeller Patch-Clamp-Opnam kéint geschéien. Besonnesch de Roumembranpotenzial an d'spontan Feierfrequenz vun Mfn2cKO Neuronen goufen net beaflosst (Figur 2, J an K). Zesummegefaasst weisen dës Resultater drop hin, datt PNe mat offensichtlecher OXPHOS-Dysfunktioun gutt mat héichfrequenten Entladungsmuster ëmgoe kënnen, wat drop hiweist, datt et e Kompensatiounsmechanismus gëtt, deen et hinnen erlaabt, bal normal elektrophysiologesch Reaktiounen z'erhalen.
D'Donnéeë ginn als Moyenne ± SEM ausgedréckt (Een-Wee-Varianzanalyse, Holm-Sidak säi Multiple-Vergläichstest; *P<0,05). D'Eenheetsnummer gëtt a Klammeren uginn.
Mir hunn eis virgeholl ze ënnersichen, ob eng Kategorie am Proteomik-Datasaz (Figur 1G) Weeër enthält, déi engem schwéiere OXPHOS-Mangel entgéintwierke kënnen, an doduerch erkläert, firwat déi betraffe PN eng bal normal Elektrophysiologie behalen kann (Figur 2, E bis K). D'Proteomik-Analyse huet gewisen, datt d'Enzymer, déi um Katabolismus vu verzweigtkettigegen Aminosaieren (BCAA) involvéiert sinn, signifikant eropreguléiert waren (Figur 3A a Figur S5A), an datt dat fäerdegt Produkt Acetyl-CoA (CoA) oder Succinyl-CoA d'Tricarboxylater am Arteriosklerose-Säurezyklus (TCA) ergänze kënnen. Mir hunn festgestallt, datt den Inhalt vun der BCAA-Transaminase 1 (BCAT1) an dem BCAT2 allebéid eropgaangen ass. Si katalyséieren den éischte Schrëtt vum BCAA-Katabolismus andeems se Glutamat aus α-Ketoglutarat generéieren (26). All Ënnereenheeten, déi de verzweigtkettige Keto-Säure-Dehydrogenase-Komplex (BCKD) ausmaachen, sinn eropreguléiert (de Komplex katalyséiert déi spéider an irreversibel Decarboxyléierung vum resultéierende BCAA-Kuelestoffskelett) (Figur 3A a Figur S5A). Wéi och ëmmer, goufen keng offensichtlech Ännerungen am BCAA selwer am sortéierte PN fonnt, déi op déi erhéicht zellulär Opnam vun dësen essentiellen Aminosaieren oder op d'Benotzung vun anere Quellen (Glukos oder Mëllechsäure) fir den TCA-Zyklus z'ergänzen zeréckzeféiere kënnen (Figur S5B). PNen, déi OXPHOS feelen, hunn och erhéicht Glutamin-Zersetzungs- an Transaminatiounsaktivitéiten am Alter vun 8 Wochen gewisen, wat sech duerch d'Upreguléierung vun de mitochondrialen Enzyme Glutaminase (GLS) a Glutaminpyruvat-Transaminase 2 (GPT2) reflektéiere kann (Figur 3, A an C). Et ass derwäert ze bemierken, datt d'Up-Reguléierung vu GLS op d'Spliced-Isoform Glutaminase C (GLS-GAC) limitéiert ass (d'Ännerung vun Mfn2cKO/CTRL ass ongeféier 4,5-fach, P = 0,05), a seng spezifesch Up-Reguléierung a Kriibsgewebe kann d'mitochondrial Bioenergie ënnerstëtzen. (27).
(A) D'Hëtztkaart weist d'Verännerung vum Proteinniveau fir de spezifizéierte Wee no 8 Wochen. (B) Beispill vun enger cerebellarer Scheif, déi mat Anti-PCx-Antikörper markéiert ass (Skala-Balke, 20 μm). De giele Pfeil weist op de Purkinje-Zellkierper. (C) Zäitverlaf-Proteinexpressionsanalyse, déi als wichtege Kandidat fir Atherosklerose identifizéiert gouf (multiple t-Test, *FDR <5%; n = 3-5 Mais). (D) Uewen: E schematescht Diagramm, dat déi verschidde Weeër weist, wéi de markéierte Kuelestoff, deen am [1-13C]Pyruvat-Tracer enthale ass, erakënnt (dh iwwer PDH oder transarteriell Streck). Ënnen: D'Geiseldiagramm weist de Prozentsaz vun eenzel markéiertem Kuelestoff (M1), deen an Asparaginsäure, Zitrounesaier an Äpfelsaier ëmgewandelt gouf, nodeems akut cerebellar Scheiwen mat [1-13C]Pyruvat markéiert goufen (gepaarten t-Test; ** P <0,01). (E) Ëmfangräich Zäitverlaf-Analyse vum ugewise Wee. Nëmme Proteine ​​mat P<0,05 no 8 Wochen berécksiichtegt ginn. Gestrechelte Linn: kee Upassungswäert (Zweiwege-Varianzanalyse; * P <0,05; *** P <0,001). D'Donnéeë ginn als Mëttelwäert ± SEM ausgedréckt.
An eiser Analyse ass de BCAA-Katabolismus zu engem vun de wichtegsten Upreguléierungsweeër ginn. Dëse Fakt weist staark drop hin, datt de Belëftungsvolumen, deen an den TCA-Zyklus erakënnt, bei PN ouni OXPHOS geännert ka sinn. Dëst kéint eng wichteg Form vun neuronaler metabolescher Rewiring duerstellen, déi en direkten Impakt op d'neuronal Physiologie an d'Iwwerliewe wärend der Erhaalung vun enger schwéierer OXPHOS-Dysfunktioun kéint hunn. Am Aklang mat dëser Hypothese hu mir festgestallt, datt den Haaptanti-atheroskleroteschen Enzym PCx eropreguléiert ass (Mfn2cKO/CTRL ännert sech ongeféier 1,5 Mol; Figur 3A), wat d'Ëmwandlung vu Pyruvat an Oxaloacetat katalyséiert (28), wat ugeholl gëtt, datt et am Gehirgewebe ass. D'Expressioun an ass op Astrozyten limitéiert (29, 30). Am Aklang mat de Proteomikresultater huet d'Konfokalmikroskopie gewisen, datt d'PCx-Expressioun spezifesch a signifikant an OXPHOS-defizienten PNs erhéicht war, während d'PCx-Reaktivitéit haaptsächlech op déi ugrenzend Bergmann-Glialzellen vun der Kontroll limitéiert war (Figur 3B). Fir déi observéiert Upreguléierung vu PCx funktionell ze testen, hu mir akut Cerebellarscheiwen mat engem [1-13C]Pyruvat-Tracer behandelt. Wéi Pyruvat duerch Pyruvat-Dehydrogenase (PDH) oxidéiert gouf, ass säin Isotop-Markéierung verschwonnen, awer gëtt an d'TCA-Zyklus-Intermediären integréiert, wann Pyruvat duerch vaskulär Reaktiounen metaboliséiert gëtt (Figur 3D). Fir eis Proteomikdaten z'ënnerstëtzen, hu mir eng grouss Zuel vu Markéierer vun dësem Tracer an der Asparaginsäure vun Mfn2cKO-Scheiwen observéiert, während Zitrounesaier an Äpfelsaier och eng moderat Tendenz haten, awer net signifikant (Figur 3D).
An den Dopaminneuronen vu MitoPark Mais mat mitochondrialer Dysfunktioun, verursaacht duerch Dopaminneuronen, déi spezifesch de mitochondriale Transkriptiounsfaktor A Gen (Tfam) zerstéieren (Figur S6B), war d'PCx-Expressioun och signifikant eropreguléiert (31), wat drop hiweist, datt Acetonsäurearteriosklerose. D'Optriede vun der Krankheet gëtt während der Dysfunktioun vum neuronalen OXPHOS am Kierper reguléiert. Et ass derwäert ze bemierken, datt et festgestallt gouf, datt eenzegaarteg Enzymer (32-34), déi an Neuronen expriméiert kënne ginn, déi mat Arteriosklerose assoziéiert kënne sinn, signifikant eropreguléiert sinn, a PNs, déi un OXPHOS feelen, wéi Propionyl-CoA Carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA konvertéiert Propionyl-CoA a Succinyl-CoA a mitochondrialen Äpfelenzym 3 (ME3), deem seng Haaptroll et ass, Pyruvat aus Malat ze gewannen (Figur 3, A an C) (33, 35). Zousätzlech hu mir eng bedeitend Erhéijung vum Pdk3-Enzym festgestallt, wat phosphoryléiert an domat PDH inaktivéiert (36), während keng Ännerungen am Pdp1-Enzym festgestallt goufen, deen PDH aktivéiert, oder am PDH-Enzymkomplex selwer (Figur 3A). Konsequent war a Mern2cKO PNs d'Phosphoryléierung vun der α1-Ënnereenheet α (PDHE1α) Ënnereenheet vun der Pyruvat-Dehydrogenase E1-Komponent vum PDH-Komplex a Ser293 (bekannt fir d'Enzymaktivitéit vu PDH ze hemmen) verstäerkt (Figur S6C) (Figur S6C). Pyruvat huet keen vaskuläre Zougang.
Schlussendlech hu mir festgestallt, datt de Superwee vun der Serin- a Glycin-Biosynthese, de verwandte mitochondriale Folat (1C)-Zyklus an d'Prolin-Biosynthese (Figur 1G a Figur S5C) all, laut Berichter, wärend dem Aktivéierungsprozess signifikant eropreguléiert sinn. Déi ëmleiend Gewëss ginn duerch mitochondrial Dysfunktioun aktivéiert (5-7). Konfokal Analysen, déi dës Proteomikdaten ënnerstëtzen, hunn gewisen, datt bei PN ouni OXPHOS, d'Cerebellarscheiwen vun 8 Wochen ale Mais der Serinhydroxymethyltransferase 2 (SHMT2) ausgesat goufen, engem Schlësselenzym vum mitochondriale Folat-Zyklus. Signifikant Immunantwort (Figur S5D). An 13 CU-Glukos-inkubéierten akuten Cerebellarscheiwen hunn d'Metabolismus-Tracing-Experimenter d'Upreguléierung vun der Serin- a Prolin-Biosynthese weider bestätegt, wat drop hiweist, datt de Flux vu Kuelestoffisoformen a Serin a Prolin zougeholl huet (Figur S5E). Well d'Reaktiounen, déi vu GLS a GPT2 gefördert ginn, fir d'Synthese vu Glutamat aus Glutamin an d'Transaminatioun tëscht Glutamat an α-Ketoglutarat verantwortlech sinn, weist hir Upreguléierung drop hin, datt OXPHOS-defizient Neuronen e verstäerkte Bedarf u Glutamat hunn. Dëst kéint drop abzielen, déi verstäerkte Biosynthese vu Prolin z'erhalen (Figur S5C). Am Géigesaz zu dësen Ännerungen huet eng proteomesch Analyse vu klenghirnen Astrozyten vu PN-spezifesche Mfn2cKO Mais gewisen, datt dës Weeër (inklusiv all Antiperoxidasen) sech net wesentlech an der Expressioun geännert hunn, wat weist, datt dës metabolesch Ëmleitung selektiv fir degradéiert PN ass (Fig. S6, D bis G).
Zesummegefaasst hunn dës Analysen signifikant ënnerschiddlech Mustere vun der zäitlecher Aktivatioun vu spezifesche metabolesche Weeër an den PNs opgedeckt. Och wann eng anormal neuronaler Mitochondriefunktioun zu fréier Atherosklerose an 1C-Remodeling féiere kann (Figur 3E an Figur S5C), a souguer virauszesoen Ännerungen an der Expressioun vun I- an IV-Komplexer, sinn d'Ännerungen an der Serin de novo-Synthese eréischt an de spéide Stadien offensichtlech. OXPHOS-Dysfunktioun (Figur 3E an Figur S5C). Dës Erkenntnisser definéieren e sequenziellen Prozess, an deem déi stressinduzéiert Mitochondrien (1C-Zyklus) an de zytoplasmatesche Prozess (Serinbiosynthese) synergistesch mat der Erhéijung vun der Atherosklerose am TCA-Zyklus reagéieren, fir den neuronalen Metabolismus nei ze gestalten.
8 Wochen al OXPHOS-defizient PNe kënnen eng héichfrequent Anregungsaktivitéit behalen an eng bedeitend metabolesch Rekonnektioun duerchmaachen, fir d'mitochondrial Dysfunktioun ze kompenséieren. Dës Entdeckung werft eng interessant Méiglechkeet op, datt och an dësem Moment dës Zellen och therapeutesch Interventiounen kréien, fir d'Neurodegeneratioun ze verzögeren oder ze verhënneren. Spéit. Mir hunn dës Méiglechkeet duerch zwou onofhängeg Interventiounen geléist. An der éischter Method hu mir e Cre-ofhängegen Adeno-assoziéierte Virus (AAV) Vektor entwéckelt, sou datt MFN2 selektiv an OXPHOS-defizienten PNe in vivo expriméiert ka ginn (Figur S7A). Den AAV, deen MFN2 kodéiert, an de fluoreszente Reportergen mCherry (Mfn2-AAV) goufen in vitro a primäre Neuronkulturen verifizéiert, wat dozou gefouert huet, datt MFN2 op eng Cre-ofhängeg Manéier expriméiert gouf an d'mitochondrial Morphologie gerett huet, wouduerch Neuromutatioun an Mfn2cKO Neuronen verhënnert gouf (Figur S7, B, D an E). Duerno hu mir in vivo Experimenter duerchgefouert fir 8 Wochen al Mfn2-AAV stereotaktesch an de cerebellare Cortex vu Mfn2cKO- a Kontrollmais ze liwweren, an 12 Wochen al Mais analyséiert (Figur 4A). Déi behandelt Mfn2cKO-Mais sinn gestuerwen (Figur 1, A an B) (16). Viral Transduktioun in vivo huet zu enger selektiver Expressioun vu PN a verschiddene cerebellare Kreesser gefouert (Figur S7, G an H). D'Injektioun vum Kontroll-AAV, deen nëmmen mCherry expriméiert (Ctrl-AAV), hat keen signifikanten Effekt op de Grad vun der Neurodegeneratioun bei Mfn2cKO-Déieren. Am Géigesaz dozou huet d'Analyse vun Mfn2cKOs, déi mat Mfn2-AAV transduzéiert goufen, e signifikanten Schutzeffekt vun der PN-Zellschicht gewisen (Figur 4, B an C). Besonnesch d'Neuronendicht schéngt bal net vun der Kontrolldéieren z'ënnerscheeden (Figur 4, B an C, a Figur S7, H an I). D'Expressioun vun MFN1, awer net vun MFN2, ass gläich effektiv fir den Neuronaldoud ze retten (Figur 4C a Figur S7, C an F), wat drop hiweist, datt d'Expressioun vun ektopeschem MFN1 de Manktem u MFN2 effektiv ergänze kann. Weider Analysen op engem eenzege PN-Niveau hunn gewisen, datt Mfn2-AAV d'Ultrastruktur vun de Mitochondrien gréisstendeels gerett huet, d'mtDNA-Niveauen normaliséiert huet an déi héich Expressioun vum Anti-Angiogenese-Marker PCx ​​​​ëmgedréit huet (Figur 4, C bis E). Eng visuell Inspektioun vun de geretteten Mfn2cKO-Mais an engem Rouzoustand huet gewisen, datt hir Haltung a motoresch Symptomer (Beweegung S1 bis S3) verbessert goufen. Zesummefaassend weisen dës Experimenter, datt eng verspéit Wiederaféierung vun MFN2 a PNen, déi eescht OXPHOS feelen, ausreecht, fir den mtDNA-Konsum ëmzedréinen an Atherosklerose ze induzéieren, wouduerch d'Axondegeneratioun an den Neuronaldoud in vivo verhënnert ginn.
(A) E Schema dat den experimentellen Zäitplang fir d'Injektioun vun AAV weist, deen MFN2 kodéiert, wann de uginnene metabolesche Wee aktivéiert ass. (B) Representativ konfokal Biller vun 12 Wochen ale klenghirnscheiwen, déi no 8 Wochen a Mfn2cKO Mais transduzéiert a mat Anti-Calbindin-Antikörper markéiert goufen. Riets: Skaléierung vun Axonfaseren. D'Skala vum Axonzoom ass 450 an 75 μm. (C) Lénks: Quantifizéierung vun der Purkinje-Zelldicht an der AAV-Transduktiounsschleef (AAV+) (Een-Wee-Varianzanalyse; n = 3 Mais). Riets: mtDNA-Fokusanalyse an transduzéierter PN an der 12. Woch (ongepaarter t-Test; n = 6 Zellen vun dräi Mais). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Representativ Transmissiounselektronemikroskopfotoe vu PNs vu Mfn2cKO klenghirnscheiwen, déi mat den uginnene virale Vektoren transduzéiert goufen. Déi rosa Mask illustréiert d'Fläch, déi vun Dendriten besat ass, an de giele punktéierte Quadrat illustréiert den Zoom, deen riets ugewise gëtt; n representéiert den Zellkär. Skala-Balk, 1μm. (E) weist e Beispill vun der PCx-Färbung a PN, déi no 12 Wochen transduzéiert gouf. Skala-Balk, 20μm. OE, Iwwerexpressioun; FC, Faltännerung.
Schlussendlech hu mir d'Wichtegkeet vum Peroxidase-induzéierten Zell-Iwwerliewe bei PNs ënnersicht, déi eng OXPHOS-Dysfunktioun haten. Mir hunn mCherry generéiert, déi AAV-shRNA (short hairpin RNA) kodéiert, déi speziell op Maus-PCx mRNA (AAV-shPCx) geriicht ass, an de Virus oder seng Scrambled Control (AAV-scr) an de Cerebellum vu Mfn2cKO-Mais injizéiert. D'Injektioun gouf an der véierter Alterswoch duerchgefouert (Figur 5A), fir en effektiven PCx-Knockdown an der Period z'erreechen, wou d'PCx-Expressioun zougeholl huet (Figur 3C) an d'PN-Zellschicht nach intakt war (Figur 1A). Et ass derwäert ze bemierken, datt d'Ofschafe vu PCx (Figur S8A) zu enger bedeitender Beschleunigung vum PN-Doud féiert, deen op den infizéierte Rank limitéiert ass (Figur 5, B an C). Fir de Mechanismus vun de metaboleschen Effekter ze verstoen, déi duerch d'PCx-Up-Reguléierung induzéiert ginn, hu mir den Redox-Status vun de PNs no der PCx-Knockdown an dem AAV-vermittelten optesche Biosensor Grx1-roGFP2 ënnersicht, déi gläichzäiteg expriméiert goufen (Figur S8, B bis D), fir d'relativ Ännerung vum Peptid-Redox-Potenzial vu Glutathion ze evaluéieren (38). Duerno hu mir eng Zwei-Photon-Fluoreszenz-Liewensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) an akuten Gehirscheiwen vu 7 Wochen ale Mfn2cKO oder Kontrollwurfgenomen duerchgefouert, fir potenziell Ännerungen am zytoplasmatesche Redox-Status no der Verifizéierung vun de FLIM-Konditiounen z'entdecken (Figur S8, E bis G). D'Analyse huet eng bedeitend Erhéijung vum Oxidatiounszoustand vun engem eenzege Mfn2cKO-PNs gewisen, deen ouni PCx-Expressioun ass, wat sech vun de Kontrollneuronen oder Mfn2cKO-PNs ënnerscheet, déi nëmmen duerchernee shRNA expriméieren (Figur 5, D an E). Wéi d'PCx-Expressioun erofreguléiert gouf, ass de Prozentsaz vun Mfn2cKO-PNs, déi en héich oxidéierten Zoustand weisen, ëm méi wéi dräimol eropgaang (Figur 5E), wat drop hiweist, datt d'PCx-Upreguléierung d'Redoxkapazitéit vun degeneréierten Neuronen erhalen huet.
(A) E Schema, deen den experimentellen Zäitplang fir d'Injektioun vun AAV, deen shPCx kodéiert, weist, wann de uginnene metabolesche Wee aktivéiert ass. (B) Representativ konfokal Fotoe vun 8 Wochen ale klenghirnsektiounen a Mfn2cKO Mais, déi no 4 Wochen transduzéiert a mat Anti-Calcineurin-Antikörper markéiert goufen. Skalabalk, 450 μm. (C) Quantifizéierung vun der Purkinje-Zelldicht an AAV-transduzéierte Schleifen (Een-Wee-Varianzanalyse; n = 3 bis 4 Mais). D'Donnéeë ginn als Moyenne ± SEM ausgedréckt; ***P < 0,001. (D) Representativt FLIM-Bild weist déi duerchschnëttlech Liewensdauer vun engem 7 Wochen ale PN, deen de Glutathion-Redox-Sensor Grx1-roGFP2 expriméiert, ënner de spezifizéierten experimentellen Konditiounen. LUT (Look-up Table) Verhältnis: Iwwerliewenszäitintervall (a Picosekonnen). Skalabalk, 25 μm. (E) Den Histogramm weist d'Verdeelung vun de Liewensdauerwäerter vum Grx1-roGFP2 vun (D) (n=158 bis 368 Zellen an zwou Mais ënner all Bedingung). D'Kuerzdiagramm iwwer all Histogramm weist d'Zuel vun den Zellen mat signifikant méi laangen (rout, oxidéiert) oder méi kuerzen (blo, reduzéiert) Liewensdauerwäerter, déi 1 SD vum duerchschnëttleche Liewensdauerwäert am CTRL-AAV-scr iwwerschreiden. (F) De proposéierte Modell weist den schützende Effekt vun der Upreguléierung vun neuronalen PCx.
Alles an allem weisen d'Donnéeën, déi mir hei ubidden, datt d'Nei-Expressioun vun MFN2 fortgeschratt PN mat schwéierem OXPHOS-Mangel, schwéierer mtDNA-Depletioun an extrem anormaler Ista-ähnlecher Morphologie komplett rette kann, wouduerch och bei fortgeschrattene Krankheeten e kontinuéierleche Fortschrëtt méiglech ass. D'Neurodegeneratioun liwwert e reversible Beweis fir de Stadium virum Zelltod. Dëse Grad vu metabolescher Flexibilitéit gëtt weider ënnerstrach duerch d'Fäegkeet vun Neuronen, Atherosklerose ze induzéieren (eng Neiverdrahtung vum TCA-Zyklus), wat d'PCx-Expressioun a PNs ouni OXPHOS hemmt an den Zelltod verstäerkt, wouduerch eng schützend Roll spillt (Figur 5F).
An dëser Studie hu mir Beweiser geliwwert, datt d'Reaktioun vun den PNs op d'OXPHOS-Dysfunktioun doran besteet, graduell zu enger TCA-Zyklus-Atherosklerose ze konvergéieren, duerch de differentiellen Aktivéierungswee, deen duerch metabolesch Programmer aktivéiert gëtt. Mir hunn d'proteomesch Analyse mat ville komplementäre Methoden bestätegt a gewisen, datt Neuronen, wa se duerch schwéier mitochondrial Dysfunktioun erausgefuerdert ginn, eng virdru onbekannt Form vun metabolescher Elastizitéit hunn. Zu eiser Iwwerraschung markéiert de ganze Rewiring-Prozess net onbedéngt den terminalen metaboleschen Zoustand, deen d'Neurodegeneratioun graduell an irreversibel begleet, awer eis Donnéeë suggeréieren, datt et e funktionelle Kompensatiounsmechanismus fir den Ënnerhalt vun Neuronen kéint sinn, och an der Phas virum Zelltod. Dëst Resultat weist drop hin, datt Neuronen e wesentleche Grad u metabolescher Plastizitéit am Kierper hunn. Dëse Fakt beweist, datt déi spéider Re-Aféierung vun MFN2 d'Expressioun vu Schlësselmetabolismusmarkéierer ëmdréie kann an d'PN-Degeneratioun verhënnere kann. Am Géigendeel, et hemmt d'Atherosklerose a beschleunegt d'Transsexuell-Nerven.
Ee vun de faszinéierendsten Erkenntnisser an eiser Fuerschung ass, datt PNs, déi OXPHOS feelen, de Metabolismus vum TCA-Zyklus modifizéieren, andeems se Enzymer eropreguléieren, déi spezifesch Arteriosklerose stimuléieren. Metabolesch Ëmorganiséierung ass e gemeinsamt Merkmal vu Kriibszellen, vun deenen e puer op Glutamin vertrauen, fir TCA-Zyklus-Zwëschenprodukter z'ergänzen, fir reduzéierend Äquivalenter ze produzéieren, déi d'Atmungskette undreiwen an d'Produktioun vu Lipid- a Nukleotidbiosynthese-Virleefer erhalen (39, 40). Eng rezent Studie huet gewisen, datt a periphere Gewëss, déi eng OXPHOS-Dysfunktioun erliewen, d'Neiverbindung vum Glutamin/Glutamat-Metabolismus och e prominent Merkmal ass (5, 41), wou d'Richtung vum Glutamin-Antrëtt an den TCA-Zyklus vun der Schwéierkraaft vun der OXPHOS-Verletzung ofhänkt (41). Wéinst der Schwéierkraaft vun der OXPHOS-Verletzung feelt et awer u kloere Beweiser fir eng Ähnlechkeet vun der neuronaler metabolescher Plastizitéit am Kierper an hirer méiglecher Relevanz am Krankheetskontext. An enger rezenter In-vitro-Studie gouf gewisen, datt primär kortikal Neuronen Glutamatpools fir d'Neurotransmissioun mobiliséieren, wouduerch den oxidativen Metabolismus an d'Atherosklerose ënner metabolesche Stressbedingungen gefördert ginn (42). Et ass derwäert ze bemierken, datt ënner der pharmakologescher Hemmung vum TCA-Zyklus-Enzym Succinatdehydrogenase, d'Pyruvat-Carboxyléierung ugeholl gëtt, d'Synthese vun Oxaloacetat an kultivéierten Neuronen aus dem Cerebellumgranula z'erhalen (34). Wéi och ëmmer, déi physiologesch Relevanz vun dëse Mechanismen fir d'Gehirgewebe (wou d'Atherosklerose haaptsächlech op Astrozyten beschränkt ass) huet ëmmer nach eng wichteg physiologesch Bedeitung (43). An dësem Fall weisen eis Donnéeën, datt PNs, déi duerch OXPHOS am Kierper beschiedegt ginn, op BCAA-Degradatioun a Pyruvat-Carboxyléierung ëmgestallt kënne ginn, déi zwou Haaptquellen vun der Ergänzung vun TCA-Pool-Intermediären sinn. Och wann de vermutleche Bäitrag vum BCAA-Katabolismus zum neuronalen Energiemetabolismus proposéiert gouf, gëtt et, zousätzlech zu der Roll vu Glutamat a GABA fir d'Neurotransmissioun (44), nach ëmmer keng Beweiser fir dës Mechanismen in vivo. Dofir ass et einfach ze spekuléieren, datt dysfunktionell PNs automatesch de Konsum vun TCA-Intermediären, deen duerch den Assimilatiounsprozess ugedriwwe gëtt, kompenséiere kënnen, andeems se d'Atherosklerose erhéijen. Besonnesch eng Upreguléierung vu PCx kann néideg sinn, fir eng erhéicht Nofro fir Asparaginsäure z'erhalen, wat a proliferéierende Zellen mat mitochondrialer Dysfunktioun ugedeit gëtt (45). Eis Metabolomikanalyse huet awer keng bedeitend Ännerungen am Steady-State-Niveau vun Asparaginsäure an Mfn2cKO PNs opgedeckt (Figur S6A), wat wahrscheinlech déi ënnerschiddlech metabolesch Notzung vun Asparaginsäure tëscht proliferéierende Zellen a post-mitoteschen Neuronen reflektéiert. Och wann de geneeë Mechanismus vun der PCx-Upreguléierung an dysfunktionellen Neuronen in vivo nach net charakteriséiert ass, hu mir gewisen, datt dës virzäiteg Reaktioun eng wichteg Roll bei der Erhaalung vum Redox-Zoustand vun Neuronen spillt, wat a FLIM-Experimenter op cerebellare Scheiwen demonstréiert gouf. Besonnesch d'Verhënnerung vun PNs dovun, PCx eropzereguléieren, kann zu engem méi oxidéierten Zoustand féieren an den Zelltod beschleunegen. D'Aktivéierung vum BCAA-Degradatioun an d'Carboxyléierung vu Pyruvat sinn keng Weeër fir d'peripher Gewëss vun der mitochondrialer Dysfunktioun ze charakteriséieren (7). Dofir schénge si eng prioritär Charakteristik vun OXPHOS-defizienten Neuronen ze sinn, och wann se net déi eenzeg Charakteristik sinn, déi fir d'Neurodegeneratioun wichteg ass.
Cerebellarerkrankung ass eng heterogen Aart vun neurodegenerativer Krankheet, déi sech normalerweis als Ataxie manifestéiert a PNs dacks beschiedegt (46). Dës Neuronpopulatioun ass besonnesch ufälleg fir mitochondrial Dysfunktioun, well hir selektiv Degeneratioun bei Mais duer geet, fir vill vun de motoresche Symptomer ze reproduzéieren, déi mënschlech Spinocerebellar Ataxie charakteriséieren (16, 47, 48). No Berichter ass e transgent Mausmodell mat engem mutanten Gen mat mënschlecher Spinocerebellarer Ataxie assoziéiert an huet mitochondrial Dysfunktioun (49, 50), wat d'Wichtegkeet vun der Studie vun de Konsequenze vun OXPHOS-Mangel bei PNPH ënnersträicht. Dofir ass et besonnesch gëeegent, dës eenzegaarteg Neuronpopulatioun effektiv ze isoléieren an ze studéieren. Wéi och ëmmer, well PNs ganz empfindlech op Drock sinn an en niddregen Undeel vun der gesamter Cerebellarzellpopulatioun ausmaachen, ass fir vill Omics-baséiert Studien déi selektiv Trennung vun hinnen als ganz Zellen ëmmer nach en usprochsvollen Aspekt. Och wann et bal onméiglech ass, en absolute Feele vu Kontaminatioun vun aneren Zelltypen (besonnesch erwuesse Gewëss) z'erreechen, hu mir en effektiven Dissoziatiounsschratt mat FACS kombinéiert, fir eng genuch Zuel vu liewensfäege Neuronen fir d'Downstream-Proteomikanalyse ze kréien, an hunn eng zimlech héich Proteinofdeckung (ongeféier 3000 Proteinen) am Verglach mam existente Datesaz vum ganze Kleinhirn (51). Duerch d'Erhale vun der Liewensfäegkeet vu ganze Zellen erlaabt eis d'Method, déi mir hei ubidden, net nëmmen d'Verännerungen an de metabolesche Weeër an de Mitochondrien ze kontrolléieren, mä och d'Verännerungen an hire zytoplasmatesche Géigestécker ze kontrolléieren, wat d'Benotzung vu mitochondrialen Membran-Tags ergänzt, fir den Zelltyp ze beräicheren. Déi nei Method fir d'Zuel vu Mitochondrien a komplexe Gewëss (52, 53). D'Method, déi mir beschreiwen, bezitt sech net nëmmen op d'Studie vu Purkinje-Zellen, mä kann einfach op all Zelltyp ugewannt ginn, fir metabolesch Verännerungen a kranke Gehirer unzegoen, dorënner och aner Modeller vun der mitochondrialer Dysfunktioun.
Schlussendlech hu mir eng therapeutesch Fënster während dësem metabolesche Reorganisatiounsprozess identifizéiert, déi déi wichtegst Zeeche vu Zellstress komplett ëmdréie kann an neuronal Degeneratioun verhënnere kann. Dofir kann d'Verständnis vun de funktionellen Implikatioune vun der hei beschriwwener Reverdrahtung fundamental Ablécker an méiglech Behandlungen fir d'Neuronal Viabilitéit während mitochondrialer Dysfunktioun z'erhalen, liwweren. Zukünfteg Fuerschung, déi op d'Disziplin vun de Verännerungen am Energiemetabolismus an aneren Gehirzelltypen abzielt, ass néideg, fir d'Uwendbarkeet vun dësem Prinzip op aner neurologesch Krankheeten vollstänneg ze weisen.
MitoPark Mais goufen schonn virdru beschriwwen (31). C57BL/6N Mais mat loxP-flankéierende Mfn2-Genen goufen schonn virdru beschriwwen (18) a mat L7-Cre Mais gekräizt (23). Déi resultéierend duebel heterozygot Nokommen goufen dann mat homozygoten Mfn2loxP/Mfn2loxP Mais gekräizt, fir Purkinje-spezifesch Gen-Knockouts fir Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) ze generéieren. An enger Ënnergrupp vun der Paarung gouf den Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP Allel (stop-mtYFP) duerch zousätzlech Kräizungen agefouert (20). All Déierprozedure goufen am Aklang mat europäeschen, nationalen an institutionellen Richtlinne duerchgefouert an vum LandesamtfürNatur vun der Ëmwelt an dem Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen, Däitschland, guttgeheescht. D'Déieraarbecht befollegt och d'Richtlinne vun der Europäescher Federatioun vun den Déiereverbänn fir Laboratoirewëssenschaften.
Nodeems d'Gebärmutterhalsdislokatioun vun der schwangerer Fra anästhetiséiert gouf, gëtt den Mausembryo isoléiert (E13). De Cortex gouf an Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ergänzt mat 10 mM Hepes dissekéiert an op Dulbecco's Modified Eagle's Medium mat Papain (20 U/ml) a Cystein (1μg/ml) weiderginn. D'Gewëss an DMEM) inkubéieren an duerch enzymatesch Verdauung dissoziéieren. Ml) bei 37°C fir 20 Minutten, an duerno mechanesch an DMEM ergänzt mat 10% fetaltem Rinderserum gemuel. D'Zellen goufen op Glasdeckglieser gesät, déi mat Polylysin mat enger Dicht vun 2×106 pro 6 cm Kulturschüssel oder mat enger Dicht vun 0,5×105 Zellen/cm2 fir d'Bildgebungsanalyse beschichtet waren. No 4 Stonnen gouf de Medium duerch Neurobasal serumfräi Medium mat 1% B27-Ergänzung an 0,5 mM GlutaMax ersat. D'Neuronen goufen dann während dem ganzen Experiment bei 37°C a 5% CO2 gehalen a goufen eemol d'Woch gefiddert. Fir d'Rekombinatioun in vitro ze induzéieren, goufen 3μl (Kulturschüssel mat 24 Wells) oder 0,5μl (Platte mat 24 Wells) vum folgenden AAV9-Virusvektor benotzt fir d'Neuronen um zweeten Dag in vitro ze behandelen: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, Katalognummer 105530-AAV9) an AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, Katalognummer 105545-AAV9).
Maus Mfn1 an Mfn2 komplementär DNA (kritt vum Addgene Plasmid #23212 bzw. #23213) sinn mat der V5 Sequenz (GKPIPNPLLGLDST) um C-Terminus markéiert a sinn mat mCherry am Frame duerch d'T2A Sequenz fusionéiert. Grx1-roGFP2 ass e Kaddo vum Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Duerch den Ersatz vun der tdTomato Kassett mat konventionelle Klonéierungsmethoden gouf d'Kassett an de pAAV-CAG-FLEX-tdTomato Backbone (Addgene Referenznummer 28306) subklonéiert fir pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 a pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 Vektoren ze generéieren. Eng ähnlech Strategie gouf benotzt fir de Kontrollvektor pAAV-CAG-FLEX-mCherry ze generéieren. Fir den AAV-shPCx-Konstrukt ze generéieren, ass e Plasmid-AAV-Vektor (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) néideg, deen d'DNA-Sequenz enthält, déi fir d'shRNA kodéiert, déi op Maus-PCx zielt (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGACGAAAG 3′). Ënner der Kontroll vum U6-Promoter gëtt mCherry ënner der Kontroll vum CMV-Promoter benotzt. D'Produktioun vun Hëllefs-AAV-Vektoren gouf no den Instruktioune vum Hiersteller (Cell Biolabs) duerchgefouert. Kuerz gesot, benotzt en Transferplasmid, deen transient den mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) oder Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kodéierende Gen, souwéi de kodéierende AAV1-Kapsidprotein an den Accessoireprotein kodéierend Plasmid-Plasmid verpackt, mat Hëllef vun der Kalziumphosphatmethod. De raue Virus-Iwwerstand gouf duerch Gefrier-Optau-Zyklen an engem Dréchenäis/Ethanolbad kritt an d'Zellen a Phosphatgepufferter Salzléisung (PBS) lyséiert. Den AAV-Vektor gouf duerch diskontinuéierlech Iodixanol-Gradient-Ultrazentrifugatioun (24 Stonnen bei 32.000 rpm a 4°C) gereinegt a mat engem Amicon ultra-15 Zentrifugalfilter konzentréiert. De Genomtiter vun AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 Genomkopie (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX gouf wéi virdru beschriwwen (54) gemooss, duerch Echtzäit-quantitativ PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) an AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Primär Neuronen goufen an äiskaler 1x PBS ofgeschaaft, pelletéiert an duerno an 0,5% Triton X-100 / 0,5% Natriumdeoxycholat/PBS Lysepuffer mat Phosphatase a Proteaseinhibitor (Roche) homogeniséiert. D'Proteinquantifizéierung gouf mat Hëllef vum Bicinchoninsäure-Assay (Thermo Fisher Scientific) duerchgefouert. D'Proteine ​​goufen duerno duerch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt an duerno op eng Polyvinylidenfluoridmembran (GE Healthcare) geblott. Net-spezifesch Plazen blockéieren an mam primären Antikörper (kuckt Tabelle S1 fir Detailer) an 5% Mëllech an TBST (Tris-gepufferter Salzléisung mat Tween) inkubéieren, Wäschschritte an sekundären Antikörper an TBST Incubate. Iwwer Nuecht mat primärem Antikörper bei +4°C inkubéieren. Nom Wäschen, den sekundären Antikörper fir 2 Stonnen bei Raumtemperatur applizéieren. Duerno, andeems dee selwechte Blot mat engem Anti-β-Aktin-Antikörper inkubéiert gouf, gouf déiselwecht Belaaschtung bestätegt. Detektioun duerch Konvertéierung a Chemilumineszenz an Verbesserung vun der Chemilumineszenz (GE Healthcare).
Déi Neuronen, déi virdru op Glasdeckglieser ausgesaat goufen, goufen zu der spezifizéierter Zäit bei Raumtemperatur fir 10 Minutten mat 4% Paraformaldehyd (PFA)/PBS fixéiert. D'Deckglieser ginn als éischt fir 5 Minutten bei Raumtemperatur mat 0,1% Triton X-100/PBS permeéiert, an duerno a Blockéierungspuffer [3% Rinderserumalbumin (BSA)/PBS]. Um zweeten Dag goufen d'Deckglieser mat Blockéierungspuffer gewäsch an 2 Stonnen mat dem passenden Fluorophor-konjugéierten sekundären Antikörper bei Raumtemperatur inkubéiert; schliisslech goufen d'Prouwe grëndlech a PBS gewäsch, wou 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) gegéintgefierft an duerno mat Aqua-Poly/Mount um Mikroskopträger fixéiert.
Mais (männlech a weiblech) goufen duerch intraperitoneal Injektioun vu Ketamin (130 mg/kg) a Xylazin (10 mg/kg) narkotiséiert a subkutan mat Carprofen-Analgetikum (5 mg/kg) verabreicht. Si goufen an en stereotaktescht Instrument (Kopf) geluecht, dat mat engem waarme Këssen ausgestatt ass. De Schädel fräileeën a mat engem Zännbuer den Deel vum klenge Hirnhirnkortex, deen dem MIS-Knach entsprécht, verdënnen (vu Lambda: Schwanz 1,8, lateral 1, entsprécht de Lobulen IV a V). Mat enger gebéiter Sprëtznol virsiichteg e klengt Lach am Schädel maachen, fir d'Gefässer drënner net ze stéieren. Dann gëtt dat dënn gezunnent Glaskapillar lues an d'Mikrolach agefouert (vun -1,3 bis -1 op der ventraler Säit vum Dura mater), an 200 bis 300 nl AAV ginn e puermol bei niddregem Drock iwwer eng Zäitperiod vun 10 bis 20 Minutte mat manuelle Sprëtzen (Narishige) an de Mikroinjektor (Narishige) injizéiert. Nom Infusioun gëtt d'Kapillär fir weider 10 Minutten opgelooss, fir datt de Virus sech komplett verbreede kann. Nodeems d'Kapilläre ewechgeholl goufen, gëtt d'Haut virsiichteg genäht, fir d'Wonnentzündung ze minimiséieren an dem Déier seng Erhuelung ze erméiglechen. D'Déiere goufen no der Operatioun e puer Deeg mat Schmerzmittel (Caspofen) behandelt, an där Zäit gouf hire kierperlechen Zoustand suergfälteg iwwerwaacht an duerno goufen se zum festgeluechten Zäitpunkt euthanaséiert. All Prozedure goufen am Aklang mat europäeschen, nationalen an institutionellen Richtlinne duerchgefouert a goufe vum LandesamtfürNatur vun der Ëmwelt- a Verbraucherschutzregioun, Nordrhein-Westfalen, Däitschland, guttgeheescht.
D'Déiere goufen mat Ketamin (100 mg/kg) a Xylazin (10 mg/kg) anästhetiséiert, an d'Häerz gouf fir d'éischt mat 0,1 M PBS an duerno mat 4% PFA a PBS perfuséiert. D'Gewief gouf dissekéiert an iwwer Nuecht bei 4°C a 4% PFA/PBS fixéiert. E vibréierend Messer (Leica Microsystems GmbH, Wien, Éisträich) gouf benotzt fir Sagittalschnëtter (50 μm déck) aus dem fixéierte Gehir a PBS ze preparéieren. Wann net anescht uginn, gouf d'Färbung vun de fräi schwiewende Schnëtter wéi uewe beschriwwen (13) bei Raumtemperatur a Réieren duerchgefouert. Kuerz gesot, fir d'éischt goufen déi kritt Scheiwen mat 0,5% Triton X-100/PBS fir 15 Minutten bei Raumtemperatur permeabiliséiert; fir verschidden Epitopen (Pcx an Shmt2), andeems d'Scheiwen amplaz vun dësem Schrëtt an Tris-EDTA-Puffer bei 80°C (pH 9) fir 25 Minutten erhëtzt goufen. Duerno goufen d'Schnëtter mat primärem Antikörper (kuckt Tabelle S1) a Blockéierungspuffer (3% BSA/PBS) bei 4°C iwwer Nuecht ënner Réieren inkubéiert. Den nächsten Dag goufen d'Schnëtter mat Blockéierungspuffer gewäsch an 2 Stonnen bei Raumtemperatur mat dem passenden Fluorophor-konjugéierten sekundären Antikörper inkubéiert; schliisslech goufen d'Schnëtter grëndlech a PBS gewäsch, mat DAPI gegéintgefierft an duerno mat AquaPolymount op engem Mikroskopträger fixéiert.
E Laser-Scanning-Konfokalmikroskop (TCS SP8-X oder TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems), dat mat engem Wäissliichtlaser an engem 405-Dioden-Ultraviolettlaser ausgestatt ass, gouf benotzt fir d'Prouf ofzebilden. Duerch d'Ureegung vum Fluorophor an d'Signal mat engem Hybriddetektor (HyDs) gouf d'LAS-X Software benotzt fir gestapelte Biller ze sammelen, déi der Nyquist-Sampling am sequenziellen Modus entspriechen: fir net-quantitativ Panelen sinn et héichdynamesch Signaler (zum Beispill a somatesche Zellen an Dendriten) (mtYFP). Benotzt HyD fir d'Zuel vun de PNs am BrightR-Modus ze detektéieren). Gating vun 0,3 bis 6 ns gëtt ugewannt fir den Hannergrond ze reduzéieren.
Echtzäit-Bildgebung vun sortéierten Zellen. Nom Sortéieren an Neurobasal-A Medium mat 1% B27 Ergänzung an 0,5 mM GlutaMax, goufen d'Zellen direkt op Poly-l-Lysin-beschichtete Glasträger (μ-Slide8 Well, Ibidi, Katalognummer 80826) ausgesaat, an duerno 1 Stonn bei 37°C a 5% CO2 gehale fir datt d'Zellen sech nidderloossen. D'Echtzäit-Bildgebung gouf mat engem Leica SP8 Laser-Scanning-Konfokalmikroskop duerchgefouert, dat mat engem wäisse Laser, HyD, 63×[1.4 numeresch Apertur (NA)] Uelegobjektivlëns an enger Heizstuf ausgestatt war.
D'Maus gouf séier mat Kuelendioxid anästhetiséiert an dekappéiert, d'Gehir gouf séier vum Schädel erausgeholl an a Sagittalschnëtter mat enger Déckt vun 200 μm (fir den 13C-Markéierungsexperiment) oder 275 μm (fir zwee Photonenexperimenter) geschnidden, déi mat de folgende Materialien gefëllt goufen. D'Glace (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Däitschland) ass mat de folgende Substanzen gefëllt: 125 mM äiskaal, mat Kuelestoff gesättigt (95% O2 a 5% CO2) Ca2-armen + kënschtlech Zerebrospinalflëssegkeet (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Natriumphosphatpuffer, 25 mM NaHCO3, 25 mM Glukos, 0,5 mM CaCl2 an 3,5 mM MgCl2 (osmoteschen Drock vun 310 bis 330 mmol). Transferéiert déi kritt Gehirscheiwen an eng Virinkubatiounskammer mat engem méi héije Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Natriumphosphatpuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-Glukos, 1,0 mM CaCl2 an 2,0 mM MgCl2) Medium) pH 7,4 an 310 bis 320 mmol).
Wärend dem Bildgebungsprozess goufen d'Scheiwen an e speziellen Bildgebungsraum verluecht, an den Experiment gouf ënner kontinuéierlecher ACSF-Perfusioun bei enger konstanter Temperatur vun 32° bis 33°C duerchgefouert. E Multiphoton-Laser-Scanning-Mikroskop (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) mat enger Leica 25x Objektivlëns (NA 0.95, Waasser), Ti:Sapphire-Laser (Chameleon Vision II, Coherent) gouf fir d'Scheiwenbildgebung benotzt. FLIM-Modul (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM vu Grx1-roGFP2. D'Ännerungen am zytoplasmatesche Redoxzoustand vun de PNs goufen duerch Zwei-Photon-FLIM a sagittale Gehirscheiwen gemooss, wou de Grx1-roGFP2 Biosensor d'PNs gezielt huet. An der PN-Schicht gëtt d'Acquisitiounsfeld ongeféier 50 bis 80 μm ënner der Scheiwoberfläch ausgewielt, fir sécherzestellen, datt et e liewensfäege PN gëtt (d.h. de Manktem u geperlteger Struktur oder neuronalen morphologesche Verännerungen laanscht d'Dendriten) an den duebel positiven roGFP2-Sensor an d'AAV-kodéierend shRNA PCx oder seng Kontrollsequenz (jiddwereen zesumme mat mCherry expriméiert). Sammelt Single-Stack-Biller mat 2x digitalem Zoom [Excitatiounswellelängt: 890 nm; 512 nm 512 Pixel]. Detektioun: intern HyD, Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Filtergrupp] an d'Bildduerchschnëttsberechnung bannent 2 bis 3 Minutte gi benotzt, fir sécherzestellen, datt genuch Photonen gesammelt ginn (am Ganzen 1000 Photonen) fir d'Kurveanpassung. D'Sensibilitéit vun der Grx1-roGFP2-Sond an d'Verifizéierung vun de FLIM-Konditioune goufen duerchgefouert andeems de Liewensdauerwäert vu roGFP2 iwwerwaacht gouf, wann exogen 10 mM H2O2 an den Perfusiouns-ACSF bäigefüügt gouf (fir d'Oxidatioun ze maximéieren, wat zu enger verlängerter Liewensdauer féiert), an duerno 2 mM Dithiothreitol bäigefüügt gouf (miniméiert de Grad vun der Reduktioun, wat zu enger Ofsenkung vun der Liewensdauer féiert) (Figur S8, D bis G). Benotzt d'FLIMfit 5.1.1 Software fir déi kritt Resultater ze analyséieren, passen déi eenzeg exponentiell Zerfallskurve vum ganze Bild un den gemoossenen IRF (Instrument-Äntwertfunktioun) un, an χ2 ass ongeféier 1. Fir d'Liewensdauer vun enger eenzeger PN ze berechnen, gouf d'Mask ronderëm den Nervenkierper manuell gezeechent, an déi duerchschnëttlech Liewensdauer an all Mask gouf fir d'Quantifizéierung benotzt.
Mitochondriepotenzialanalyse. Nodeems déi akut Sektioun mat 100 nM TMRM inkubéiert gouf, deen direkt an den perfuséierten ACSF fir 30 Minutten bäigefüügt gouf, goufen d'Verännerunge vum mitochondriale Potenzial vun de PNs mat engem Zwei-Photonenmikroskop gemooss. D'TMRM-Bildgebung gouf duerchgefouert andeems d'Sond bei 920 nm ugehuewe gouf an intern HyD (Tetramethylrhodaminisothiocyanat: 585/40 nm) benotzt gouf fir Signaler ze sammelen; andeems déiselwecht Anregungswellelängt awer en aneren internen HyD (FITC: 525/50) benotzt gouf fir mtYFP ofzebilden. Benotzt den Image Calculator Plug-in vun ImageJ fir de mitochondriale Potenzial op eenzel Zellniveau ze evaluéieren. Kuerz gesot, d'Plug-in-Equatioun: signal = min (mtYFP, TMRM) gëtt benotzt fir déi mitochondrial Regioun z'identifizéieren, déi den TMRM-Signal am Purkinje Somali am Single-Stack-Konfokalbild vum entspriechende Kanal weist. Dann gëtt d'Pixelfläch an der resultéierender Mask quantifizéiert an dann op dem entspriechende Schwellwäert-Single-Stack-Bild vum mtYFP-Kanal normaliséiert, fir d'mitochondrial Fraktioun ze kréien, déi de mitochondriale Potenzial weist.
D'Bild gouf mat der Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) Software entkonvolutéiert. Fir déi gescannt Biller vu Plättercher gëtt d'Montage vun enger eenzeger Plättercher mat dem automateschen Néckelalgorithmus vun der LAS-X Software gemaach. No der Bildkalibratioun benotzt ImageJ an Adobe Photoshop fir d'Bild weider ze veraarbechten an d'Hellegkeet an de Kontrast gläichméisseg unzepassen. Benotzt Adobe Illustrator fir d'Grafikvirbereedung.
mtDNA Fokusanalyse. D'Zuel vun den mtDNA Läsiounen gouf op klenghirnen Schnëtter quantifizéiert, déi mat Antikörper géint DNA markéiert waren, mat engem konfokale Mikroskop. All Zilberäich gouf fir den Zellkierper an den Zellkär vun all Zell erstallt, an déi jeeweileg Fläch gouf mat dem Multi Measure Plug-in (ImageJ Software) berechent. Subtrahéiert d'Zellkärfläch vun der Zellkierperfläch fir d'zytoplasmatesch Fläch ze kréien. Schlussendlech gouf den Analyze Particles Plug-in (ImageJ Software) benotzt fir automatesch d'zytoplasmatesch DNA Punkten ze quantifizéieren, déi mtDNA um Schwellbild uginn, an déi kritt Resultater goufen op den PN Duerchschnëtt vu CTRL Mais normaliséiert. D'Resultater ginn als duerchschnëttlech Zuel vun Nukleosiden pro Zell ausgedréckt.
Proteinexpressionsanalyse. Benotzt den Image Calculator Plug-in vun ImageJ fir d'Proteinexpression an der PN op eenzelzellegem Niveau ze evaluéieren. Kuerz gesot, am Eenzelschicht-Konfokalbild vum entspriechende Kanal, duerch d'Equatioun: Signal = min (mtYFP, Antikörper), gëtt déi mitochondrial Regioun identifizéiert, déi Immunoreaktivitéit op e bestëmmten Antikörper am Purkina weist. Dann gëtt d'Pixelfläch an der resultéierender Mask quantifizéiert an dann op dem entspriechende Schwell-Eenzelstackbild vum mtYFP-Kanal normaliséiert, fir de mitochondriale Fraktioun vum ugewise Protein ze kréien.
Purkinje-Zelldichtanalyse. De Cell Counter Plugin vun ImageJ gouf benotzt fir d'Purkinje-Dicht ze evaluéieren andeems d'Zuel vun de gezielte Purkinje-Zellen duerch d'Längt vum klenge Hirnrank gedeelt gouf, deen vun de gezielten Zellen besat ass.
Proufvirbereedung a Proufsammlung. D'Gehirer vun der Kontrollgrupp an den Mfn2cKO-Mais goufen an 2% PFA/2,5% Glutaraldehyd an 0,1 M Phosphatpuffer (PB) fixéiert, an duerno goufen d'Koronalschnëtter mat Ciliaten (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Éisträich) (Déckt 50 bis 60 μm) virbereet. Duerno goufen se 1 Stonn bei Raumtemperatur a PB-Puffer an 1% os-Tetraoxid an 1,5% Kaliumferrocyanid fixéiert. D'Schnëtter goufen dräimol mat destilléiertem Waasser gewäsch an duerno 20 Minutte laang mat 70% Ethanol mat 1% Uranylacetat gefierft. D'Schnëtter goufen dann a graduéiertem Alkohol dehydréiert an an Durcupan ACM (Araldite Casting Resin M) Epoxyharz (Electron Microscopy Sciences, Katalognummer 14040) tëscht Siliziumbeschichtete Glasträger agebett an schliisslech bei 60°C 48 Stonnen am Uewen polymeriséiert. De Beräich vum klenge Hirnhirnkortex gouf ausgewielt an 50 nm ultradënn Schnëtter goufen op engem Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Éisträich) geschnidden an op engem 2×1 mm Kupferschlitzgitter, dat mat Polystyrolfilm beschichtet war, erausgeholl. D'Schnëtter goufen 10 Minutte mat enger Léisung vu 4% Uranylacetat an H2O gefierft, e puer Mol mat H2O gewäsch, duerno 10 Minutte mat Reynolds-Bläicitrat an H2O, an duerno e puer Mol mat H2O gewäsch. Mikroskopesch Fotoe goufe mat engem Transmissiounselektronemikroskop Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mat enger TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 Digitalkamera (TVIPS GmbH, Gauting, USA, Däitschland) gemaach.
Bei Mais, déi mat AAV infizéiert waren, gouf d'Gehir getrennt an an eng 1 mm déck Sagittalschnitt geschnidden, an de Kleinhirn gouf mat engem Fluoreszenzmikroskop ënnersicht fir den AAV-infizéierte Rank z'identifizéieren (d.h. mCherry-Expressioun). Nëmmen Experimenter, an deenen d'AAV-Injektioun zu enger ganz héijer Transduktiounseffizienz vun der Purkinje-Zellschicht (d.h. bal der ganzer Schicht) an op d'mannst zwee hannereneen Kleinhirnréng féiert, goufen benotzt. Déi mat AAV transduzéiert Schleif gouf fir eng Nuecht Postfixatioun mikrodissekéiert (4% PFA an 2,5% Glutaraldehyd an 0,1 M Kokoatpuffer) a weider veraarbecht. Fir d'EPON-Ambedding gouf dat fixéiert Gewief mat 0,1 M Natriumkokoatpuffer (Applichem) gewäsch an 4 Stonnen mat 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) an 0,1 M Natriumkokoatpuffer (Applichem) inkubéiert, duerno 2 Stonnen gewäsch. 3 Mol mat 0,1 M Kokamidpuffer widderhuelen. Duerno gouf déi opsteigend Serie vun Ethanol benotzt fir all Ethanolléisung 15 Minutten bei 4°C ze inkubéieren, fir d'Gewief ze dehydratiséieren. D'Gewief gouf op Propylenoxid transferéiert an iwwer Nuecht an EPON (Sigma-Aldrich) bei 4°C inkubéiert. D'Gewief gouf 2 Stonnen bei Raumtemperatur a frëschem EPON geluecht an dann 72 Stonnen bei 62°C agebett. Benotzt en Ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) an en Diamantmesser (Diatome, Biel, Schwäiz) fir 70 nm ultradënn Schnëtter ze schneiden, a faarft se 15 Minutten bei 37°C mat 1,5% Uranylacetat a 4 Minutten mat enger Bleicitratléisung. D'Elektronemikroskopfotoe goufe mat engem JEM-2100 Plus Transmissiounselektronemikroskop (JEOL) gemaach, deen mat Camera OneView 4K 16-Bit (Gatan) an DigitalMicrograph Software (Gatan) ausgestatt war. Fir d'Analyse goufen Elektronemikroskopesch Opname mat 5000× oder 10.000× digitalem Zoom opgeholl.
Morphologesch Analyse vun de Mitochondrien. Fir all Analysen goufen d'Konturen vun den eenzelne Mitochondrien manuell an digitale Biller mat der ImageJ Software duergestallt. Verschidde morphologesch Parameter ginn analyséiert. D'Mitochondrialdicht gëtt als Prozentsaz ausgedréckt, deen duerch d'Divisioun vun der gesamter Mitochondrienfläch vun all Zell duerch d'Zytoplasmafläch (Zytoplasmafläch = Zellfläch-Zellkärfläch) × 100 kritt gëtt. D'Ronnheet vun de Mitochondrien gëtt mat der Formel [4π∙(Fläch/Perimeter 2)] berechent. D'Ista-Morphologie vun de Mitochondrien gouf analyséiert an no hiren Haaptformen an zwou Kategorien ("röhrenförmig" a "Blosen") opgedeelt.
Analyse vun der Zuel an der Dicht vun Autophagosomen/Lysosomen. Benotzt d'ImageJ Software fir manuell d'Konturen vun all Autophagosom/Lysosom am digitale Bild ze skizzéieren. D'Fläch vun den Autophagosomen/Lysosomen gëtt als Prozentsaz ausgedréckt, deen berechent gëtt andeems d'Gesamtstrukturfläch vun den Autophagosomen/Lysosomen vun all Zell duerch d'Zytoplasmafläch gedeelt gëtt (Zytoplasmafläch = Zellfläch-Kärfläch) × 100. D'Dicht vun den Autophagosomen/Lysosomen gëtt berechent andeems d'Gesamtzuel duerch d'Zuel vun den Autophagosom-/Lysosomstrukturen pro Zell (a Bezuch op d'Zytoplasmafläch) gedeelt gëtt (Zytoplasmafläch = Zellfläch-Kärfläch).
Etikettéierung fir akut Schnëttéierung a Proufvirbereedung. Fir Experimenter, déi Glukosmarkéierung erfuerderen, transferéiert d'akut Gehirscheiwen an eng Virinkubatiounskammer, déi gesättigte Kuelestoff (95% O2 a 5% CO2), héich Ca2+ ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Natriumphosphatpuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-Glukos, 1,0 mM CaCl2 an 2,0 mM MgCl2, ugepasst op pH 7,4 an 310 bis 320 mOsm) enthält, an deem Glukos 13C6-Glukossubstitutioun ass (Eurisotop, Katalognummer CLM-1396). Fir Experimenter, déi Pyruvat-Markéierung erfuerderen, transferéiert d'akut Gehirscheiwen an eng méi héich Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Natriumphosphatpuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-Glukos, 1,0 mM CaCl2 a füügt 2,0 mM MgCl2 derbäi, astellt de pH-Wäert op 7,4 an 310 bis 320 mOsm), an füügt 1 mM 1-[1-13C]pyruvat (Eurisotop, Katalognummer CLM-1082) derbäi. Inkubéiert d'Schnëtter fir 90 Minutten bei 37°C. Um Enn vum Experiment goufen d'Schnëtter séier mat enger wässerlecher Léisung (pH 7,4) mat 75 mM Ammoniumkarbonat gewäsch, an duerno an 40:40:20 (v:v:v) Acetonitril (ACN):Methanol:Waasser homogeniséiert. Nodeems d'Schnëtter 30 Minutten op Äis inkubéiert waren, goufen d'Prouwe fir 10 Minutten bei 4°C mat 21.000 g zentrifugéiert, an den transparenten Iwwerstand gouf an engem SpeedVac-Konzentrator gedréchent. De resultéierende gedréchente Metabolitpellet gouf bis zur Analyse bei -80°C gelagert.
Flëssegchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse vun 13C-markéierten Aminosaieren. Fir d'Flëssegchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)-Analyse gouf de Metabolitpellet a 75μl LC-MS-Waasser (Honeywell) resuspendéiert. Nom Zentrifugéiere bei 21.000 g fir 5 Minutten bei 4°C goufen 20 μl vum gekläerte Supernatant fir d'Aminosaierfluxanalyse benotzt, während de Rescht vum Extrakt direkt fir d'Anionanalyse benotzt gouf (kuckt ënnen). D'Aminosaieranalyse gouf mat dem virdru beschriwwene Benzoylchlorid-Derivatiséierungsprotokoll duerchgefouert (55, 56). Am éischte Schrëtt goufen 10μl 100 mM Natriumkarbonat (Sigma-Aldrich) zu 20μl Metabolit-Extrakt bäigefüügt, an duerno goufen 10μl 2% Benzoylchlorid (Sigma-Aldrich) zum LC-Grad ACN bäigefüügt. D'Prouf gouf kuerz gevirbelt an duerno 5 Minutten bei 20°C bei 21.000 g zentrifugéiert. Den gekläerte Supernatant an eng 2 ml Autosampler-Fläsch mat engem konischen Glasasaz (200 μl Volumen) transferéiert. D'Prouwe goufen mat dem Acquity iClass Ultra-High-Performance LC System (Waters) analyséiert, deen un de Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) Héichopléisungs-Präzisiounsmassenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) ugeschloss war. Fir d'Analyse goufen 2μl vun der derivatiséierter Prouf an eng 100×1,0 mm Héichfestigkeitssiliziumdioxid T3-Sail (Waters) injizéiert, déi 1,8μm Partikelen enthält. D'Duerchflussquote ass 100μl/min, an de Puffersystem besteet aus Puffer A (10 mM Ammoniumformat an 0,15% Amberesäure a Waasser) a Puffer B (ACN). De Gradient ass wéi follegt: 0%B no 0 Minutten; 0%B. 0 bis 15% B bei 0 bis 0,1 Minutten; 15 bis 17% B bei 0,1 bis 0,5 Minutten; B bei 17 bis 55% bei 0,5 bis 14 Minutten; B bei 55 bis 70% bei 14 bis 14,5 Minutten; bei 14,5 bis 70 bis 100% B bei 18 Minutten; 100% B bei 18 bis 19 Minutten; 100 bis 0% B bei 19 bis 19,1 Minutten; 0% B bei 19,1 bis 28 Minutten (55, 56). De QE-HF Massespektrometer funktionéiert am positive Ioniséierungsmodus mat engem Masseberäich vun m/z (Mass/Ladungsverhältnis) vu 50 bis 750. Déi ugewandte Resolutioun ass 60.000, an d'Ionenziel fir d'Verstärkungskontroll (AGC) ass 3×106, an déi maximal Ionenzäit ass 100 Millisekonnen. Déi erhëtzt Elektrospray-Ioniséierungsquell (ESI) funktionéiert mat enger Sprëtzspannung vun 3,5 kV, enger Kapillartemperatur vun 250°C, engem Hülleloftstroum vun 60 AU (arbiträr Eenheeten) an engem Hëllefsloftstroum vun 20 AU bis 250°C. D'S-Lëns ass op 60 AU agestallt.
Anionenchromatographie-MS-Analyse vun 13C-markéierten organesche Saieren. De verbleiwene Metabolit-Präzipitat (55μl) gouf mat engem Dionex-Ionenchromatographiesystem (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) analyséiert, dat mat engem QE-HF-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) verbonnen ass. Kuerz gesot, 5μl Metabolit-Extrakt goufen an eng Dionex IonPac AS11-HC-Sail mat HPLC (2 mm × 250 mm, Partikelgréisst 4μm, Thermo Fisher Scientific) am Push-in-Partial-Loop-Modus mat engem Fëllverhältnis vun 1 injizéiert. Dionex IonPac AG11-HC Schutzsail (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific) gëtt op 30°C gehalen, an den Autosampler gëtt op 6°C agestallt. Benotzt eng Kaliumhydroxid-Kartusch mat deioniséiertem Waasser fir e Kaliumhydroxidgradient duerch den Eluentgenerator ze generéieren. Trennung vu Metabolitten mat enger Duerchflussrate vun 380 μl/min, mat der Uwendung vum folgende Gradient: 0 bis 3 Minutten, 10 mM KOH; 3 bis 12 Minutten, 10 bis 50 mM KOH; 12 bis 19 Minutten, 50 bis 100 mM KOH; 19 bis 21 Minutten, 100 mM KOH; 21 bis 21,5 Minutten, 100 bis 10 mM KOH. D'Kolonn gouf ënner 10 mM KOH fir 8,5 Minutten nei ausgeglach.
Déi eluéiert Metabolitte ginn no der Kolonn mat engem 150μl/min Isopropanol-Zousazstroum kombinéiert an dann an e Massespektrometer mat héijer Opléisung geleet, deen am negativen Ioniséierungsmodus funktionéiert. Den MS iwwerwaacht de Masseberäich vun m/z 50 bis 750 mat enger Opléisung vu 60.000. Den AGC ass op 1×106 agestallt, an déi maximal Ionenzäit gëtt op 100 ms gehalen. Déi erhëtzt ESI-Quell gouf mat enger Sprëtzspannung vun 3,5 kV bedriwwen. Déi aner Astellungen vun der Ionenquell sinn wéi follegt: Kapillartemperatur 275°C; Hüllegasstroum, 60 AU; Hëllefsgasstroum, 20 AU bei 300°C, an S-Lënsenastellung op 60 AU.
Datenanalyse vun 13C-markéierte Metabolitten. Benotzt d'TraceFinder Software (Versioun 4.2, Thermo Fisher Scientific) fir d'Datenanalyse vum Isotopverhältnis. D'Identitéit vun all Verbindung gouf duerch eng zouverlässeg Referenzverbindung verifizéiert an onofhängeg analyséiert. Fir d'Isotopanreicherungsanalyse duerchzeféieren, gouf d'Fläch vum extrahéierten Ionenchromatogramm (XIC) vun all 13C-Isotop (Mn) aus [M + H]+ extrahéiert, wou n d'Kuelestoffzuel vun der Zilverbindung ass, déi fir d'Analyse vun Aminosäuren oder [MH]+ benotzt gëtt fir d'Analyse vun Anionen. D'Massegenauegkeet vun XIC ass manner wéi fënnef Deeler pro Millioun, an d'Genauegkeet vun RT ass 0,05 Minutten. D'Anreicherungsanalyse gëtt duerch d'Berechnung vum Verhältnis vun all detektéierten Isotop zu der Zomm vun allen Isotopen vun der entspriechender Verbindung duerchgefouert. Dës Verhältnisser ginn als Prozentsazwäerter fir all Isotop uginn, an d'Resultater ginn als molare Prozentsazanreicherung (MPE) ausgedréckt, wéi virdru beschriwwen (42).
De gefruerene Neuronpellet gouf an äiskaalt 80% Methanol (v/v) homogeniséiert, gevirbelt an 30 Minutten bei -20°C inkubéiert. D'Prouf nach eng Kéier gevirbelt a 30 Minutten bei +4°C réieren. D'Prouf gouf 5 Minutten bei 4°C bei 21.000 g zentrifugéiert, an duerno gouf den resultéierenden Iwwerstand gesammelt an mat engem SpeedVac-Konzentrator bei 25°C fir eng spéider Analyse gedréchent. Wéi uewe beschriwwen, gouf eng LC-MS-Analyse op den Aminosaieren vun den sortéierte Zellen duerchgefouert. Mat TraceFinder (Versioun 4.2, Thermo Fisher Scientific) gouf d'Datenanalyse mat der monoisotopescher Mass vun all Verbindung duerchgefouert. D'Quantilnormaliséierung vun de Metabolitdaten gouf mat dem preprocessCore Softwarepaket (57) duerchgefouert.
Virbereedung vun de Schnëtter. D'Maus gouf séier mat Kuelendioxid anästhetiséiert an de Kapp ofgeschnidden, d'Gehir gouf séier vum Schädel erausgeholl, an dat mat Äis gefëllte Vibratiounsmesser (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Däitschland) gouf benotzt fir se a Sagittalschnittsgréissten vun 300 bis 375 μm ze schneiden. Kal Kuelestoffvergasung (95% O2 a 5% CO2) Niddereg Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Natriumphosphatpuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-Glukos, 1,0 mM CaCl2 a 6,0 mM MgCl2 Astellen op pH 7,4 an 310 bis 330 mOsm). Transferéiert déi kritt Gehirscheiwen an eng Kammer mat engem méi héije Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Natriumphosphatpuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-Glukos, 4,0 mM CaCl2 an mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 an 310 bis 320 mOsm). Späichert d'Scheiwen fir 20 bis 30 Minutten, fir datt se virun der Opnam restauréiert kënne ginn.
Opnam. Fir all Opname gouf e Mikroskopstull mat enger fixer Opnamkammer an enger 20x Waasserimmersionsobjektivlëns (Scientifica) benotzt. Déi mutmasslech Purkinje-Zellen goufen duerch (i) Kierpergréisst, (ii) anatomesch Lag vum Kleinhirn an (iii) Expressioun vum fluoreszenten mtYFP-Reportergen identifizéiert. D'Patch-Pipette mat engem Spëtzwiderstand vu 5 bis 11 Megaohm gëtt duerch e Borosilikatglaskapillar (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Däitschland) an eng horizontal Pipett vun Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA) erausgezunn. All Opname goufen mam ELC-03XS npi Patch-Clamp-Verstärker (npi electronic GmbH, Tam, Däitschland) duerchgefouert, deen vun der Software Signal (Versioun 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK) gesteiert gouf. Den Experiment gouf mat enger Samplingrate vun 12,5 kHz opgeholl. D'Signal gëtt mat zwéi Kuerzduerchgangs-Bessel-Filter mat Ofgrenzungsfrequenzen vun 1,3 respektiv 10 kHz gefiltert. D'Kapazitéit vun der Membran an der Pipett gëtt duerch de Kompensatiounsschaltkrees mat Hëllef vum Verstärker kompenséiert. All Experimenter goufen ënner der Kontroll vun enger Orca-Flash 4.0 Kamera (Hamamatsu, Gerden, Däitschland) duerchgefouert, déi vun der Hokawo Software (Versioun 2.8, Hamamatsu, Gerden, Däitschland) gesteiert gouf.
Routine Ganzzellkonfiguratioun an Analyse. Direkt virun der Opnam gëtt d'Pipette mat der interner Léisung gefëllt, déi folgend Substanzen enthält: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM Kaliumgluconat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanosintriphosphat (GTP) (Na) an 10,0 mM Kreatininphosphat goufen op pH 7,25 ugepasst, an den osmoteschen Drock war 290 mOsm (Saccharose). Direkt nodeems eng Kraaft vun 0 pA ugewannt gouf fir d'Membran ze briechen, gouf de Roumembranpotential gemooss. Den Inputwidderstand gëtt gemooss andeems hyperpolariséiert Stréim vun -40, -30, -20 an -10 pA ugewannt ginn. Mooss d'Gréisst vun der Spannungsantwort a benotzt Ohm säi Gesetz fir den Inputwidderstand ze berechnen. Spontan Aktivitéit gouf 5 Minutten an enger Spannungsklemm opgeholl, an sPSC gouf am Igor Pro (Versioun 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) identifizéiert a gemooss mat engem semi-automateschen Erkennungsskript. D'IV-Kurve an de stationäre Stroum ginn gemooss andeems d'Batterie op verschiddene Potenzialer (ugefaange vun -110 mV) festgeklemmt an d'Spannung a Schrëtt vu 5 mV erhéicht gëtt. D'Produktioun vun AP gouf getest andeems en depolariséierende Stroum ugewannt gouf. Klemmt d'Zell op -70 mV fest, während en depolariséierende Stroumimpuls ugewannt gëtt. Passt d'Schrëttgréisst vun all Opnamunitéit separat un (10 bis 60 pA). Berechent déi maximal AP-Frequenz andeems Dir manuell d'Pulsspëtzen zielt, déi déi héchst AP-Frequenz verursaachen. Den AP-Schwellwäert gëtt analyséiert andeems déi zweet Ofleedung vum Depolarisatiounsimpuls benotzt gëtt, deen als éischt een oder méi APs ausléist.
Konfiguratioun an Analyse vum perforéierte Patch. Féiert eng perforéiert Patch-Opzeechnung mat Standardprotokoller duerch. Benotzt eng ATP- a GTP-fräi Pipett, déi déi folgend Zutaten net enthält: 128 mM Gluconat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA an 2 mM MgCl2, a passt de pH-Wäert op 7,2 un (mat KOH). ATP an GTP ginn aus der intrazellulärer Léisung ewechgelooss, fir eng onkontrolléiert Permeabilitéit vun der Zellmembran ze verhënneren. D'Patch-Pipett gëtt mat enger amphotericin-halteger interner Léisung (ongeféier 200 bis 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) gefëllt, fir e gestanzte Patch-Opzeechnung ze kréien. Amphotericin gouf an Dimethylsulfoxid opgeléist (Endkonzentratioun: 0,1 bis 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). D'Konzentratioun vum benotzten DMSO hat keen signifikanten Effekt op déi ënnersicht Neuronen. Wärend dem Stanzprozess gouf de Kanalwidderstand (Ra) kontinuéierlech iwwerwaacht, an den Experiment gouf gestart nodeems d'Amplitude vu Ra an AP stabiliséiert war (20-40 Minutten). D'spontan Aktivitéit gëtt an enger Spannungs- an/oder Stroumklemm fir 2 bis 5 Minutten gemooss. D'Datenanalyse gouf mat Igor Pro (Versioun 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (Versioun 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) a GraphPad Prism (Versioun 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Vereenegt Staaten) duerchgefouert. Fir spontan APs z'identifizéieren, gëtt den NeuroMatic v3.0c Plugin vun IgorPro benotzt. Identifizéiert APs automatesch mat engem bestëmmte Schwellwäert, deen individuell fir all Datebank ugepasst gëtt. Mat Hëllef vum Spike-Intervall gëtt d'Spike-Frequenz mat der maximaler momentaner Spike-Frequenz an der duerchschnëttlecher Spike-Frequenz bestëmmt.
PN-Isolatioun. Duerch d'Upassung un dat virdru publizéiert Protokoll goufen PNs aus dem Maus-Cerebellum an engem spezifizéierte Stadium gereinegt (58). Kuerz gesot, gouf de Cerebellum dissekéiert a gehackt an äiskaalt Dissoziatiounsmedium [ouni HBSS Ca2+ an Mg2+, ergänzt mat 20 mM Glukos, Penicillin (50 U/ml) a Streptomycin (0,05 mg/ml)], an duerno gouf de Medium a Papain verdaut [HBSS, ergänzt mat 1-Cystein·HCl (1 mg/ml), Papain (16 U/ml) an Deoxyribonuklease I (DNase I; 0,1 mg/ml)]. 30 Minutte bei 30°C behandelen. Fir d'éischt d'Gewëss an HBSS-Medium mat Eeërschleim (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) an DNase (0,1 mg/ml) bei Raumtemperatur wäschen, fir enzymatesch Verdauung ze verhënneren, an dann an HBSS-Medium mat 20 mM Glukos. Ënner sanftem Malen an HBSS, Penicillin (50 U/ml), Streptomycin (0,05 mg/ml) an DNase (0,1 mg/ml) fräisetzen eenzel Zellen. Déi resultéierend Zellsuspensioun gouf duerch e 70μm Zellsieb gefiltert, duerno goufen d'Zellen duerch Zentrifugatioun (1110 rpm, 5 Minutten, 4°C) pelletéiert an am Sortiermedium [HBSS, ergänzt mat 20 mM Glukos, 20% fetalt Rinderserum, Penicillin (50 U/ml) a Streptomycin (0,05 mg/ml)] resuspendéiert; d'Zellviabilitéit mat Propidiumiodid evaluéieren an d'Zelldicht op 1×106 bis 2×106 Zellen/ml upassen. Virun der Flowzytometrie gouf d'Suspension duerch e 50 μm Zellsieb gefiltert.
Flowcytometer. D'Zellsortéierung gouf bei 4°C mat enger FACSAria III Maschinn (BD Biosciences) an FACSDiva Software (BD Biosciences, Versioun 8.0.1) duerchgefouert. D'Zellsuspensioun gouf mat enger 100 μm Düse ënner engem Drock vun 20 psi mat enger Rate vun ~2800 Events/Sekonn sortéiert. Well traditionell Gating-Kriterien (Zellgréisst, bimodal Diskriminéierung a Streuungseigenschaften) net déi korrekt Isolatioun vu PN vun aneren Zelltypen garantéieren kënnen, gëtt d'Gating-Strategie op Basis vum direkten Verglach vun der YFP-Intensitéit an Autofluoreszenz bei mitoYFP+ ​​an de Kontroll mitoYFP − Mais festgeluecht. YFP gëtt ugereegt andeems d'Prouf mat enger 488 nm Laserlinn bestraalt gëtt, an de Signal gëtt mat engem 530/30 nm Bandpassfilter detektéiert. Bei mitoYFP+ ​​Mais gëtt déi relativ Stäerkt vum Rosa26-mitoYFP Reportergen och benotzt fir Neuronalkierper- an Axonfragmenter z'ënnerscheeden. 7-AAD gëtt mat engem 561 nm giele Laser ugereegt an mat engem 675/20 nm Bandpassfilter detektéiert fir dout Zellen auszeschléissen. Fir gläichzäiteg Astrozyten ze trennen, gouf d'Zellsuspensioun mat ACSA-2-APC gefierft, duerno gouf d'Prouf mat enger 640 nm Laserlinn bestraalt, an e 660/20 nm Bandpassfilter gouf benotzt fir d'Signal ze detektéieren.
Déi gesammelt Zellen goufen duerch Zentrifugatioun (1110 rpm, 5 Minutten, 4°C) pelletéiert a bis zur Benotzung bei -80°C gelagert. Mfn2cKO Mais an hir Jonker ginn um selwechten Dag klasséiert, fir d'prozedural Variabilitéit ze minimiséieren. D'FACS-Datenpresentatioun an d'Analyse goufen mat der FlowJo Software (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) duerchgefouert.
Wéi uewe scho gesot (59), gëtt Echtzäit-PCR benotzt fir DNA aus den sortéierten Neuronen fir eng spéider mtDNA-Quantifizéierung ze isoléieren. D'Linearitéit an d'Schwellempfindlechkeet goufen ufanks getest andeems qPCR op verschiddenen Zuelen vun Zellen duerchgefouert gouf. Kuerz gesot, 300 PN an engem Lysepuffer gesammelt, deen aus 50 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 a Proteinase K (200 ng/ml) besteet, an 120 Minutten bei 55°C inkubéiert. D'Zellen goufen weider 10 Minutten bei 95°C inkubéiert fir eng komplett Inaktivéierung vun der Proteinase K ze garantéieren. Mat enger TaqMan-Sond (Thermo Fisher), déi spezifesch fir mt-Nd1 ass, gouf mtDNA duerch semi-quantitativ PCR am 7900HT Echtzäit-PCR-System (Thermo Fisher Scientific) gemooss. Science, Katalognummer Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, Katalognummer AIVI3E8) an 18S (Thermo Fisher Scientific, Katalognummer Hs99999901_s1) Genen.
Virbereedung vun der Proteomprobe. Duerch d'Erhëtzung vun der Léisung bei 95°C fir 10 Minutten an d'Sonikatioun am Lysepuffer [6 M Guanidinchlorid, 10 mM Tris(2-Carboxyethyl)phosphinhydrochlorid, 10 mM Chloracetamid an 100 mM Tris-Lyse gefruer Neuronpellets an HCl]. Op Bioruptor (Diagenode) fir 10 Minutten (30 Sekonnen Puls / 30 Sekonnen Paus). D'Probe gouf 1:10 an 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) verdënnt, mat 300 ng Trypsin Gold (Promega) gemëscht an iwwer Nuecht bei 37°C inkubéiert fir eng komplett Verdauung z'erreechen. Um zweeten Dag gouf d'Probe bei 20.000 g fir 20 Minutten zentrifugéiert. Den Iwwerstand gouf mat 0,1% Ameensäure verdënnt, an d'Léisung gouf mat selwer hiergestallten StageTips entsalzt. D'Prouf gouf an engem SpeedVac-Instrument (Eppendorf-Konzentrator plus 5305) bei 45°C gedréchent, an duerno gouf de Peptid an 0,1% Ameensäure suspendéiert. All Prouwe goufe gläichzäiteg vun der selwechter Persoun virbereet. Fir d'Astrozytenprouwe z'analyséieren, goufen 4 μg entsalzt Peptiden mat engem Tandem-Mass-Tag (TMT10plex, Katalognummer 90110, Thermo Fisher Scientific) mat engem Peptid-TMT-Reagens-Verhältnis vun 1:20 markéiert. Fir d'TMT-Markéierung goufen 0,8 mg TMT-Reagens an 70 μl wasserfreiem ACN resuspendéiert, an dat gedréchent Peptid gouf an 9 μl 0,1 M TEAB (Triethylammoniumbikarbonat) rekonstituéiert, zu deem 7 μl TMT-Reagens an ACN bäigefüügt goufen. D'Konzentratioun war 43,75%. No 60 Minutte Inkubatioun gouf d'Reaktioun mat 2 μl 5% Hydroxylamin ofgekillt. Déi markéiert Peptiden goufen gesammelt, gedréchent, an 200 μl 0,1% Ameensäure (FA) resuspendéiert, an zwee gedeelt an duerno mat selwer hiergestallte StageTips entsalzt. Mat engem UltiMate 3000 Ultra-Héichleistungs-Flëssegkeetschromatograph (UltiMate 3000 Ultra-Héichleistungs-Flëssegkeetschromatograph) gouf eng vun den zwou Hälften op enger 1 mm x 150 mm Acquity Chromatographiesail fraktionéiert, déi mat 130 Å1,7 μm C18-Partikelen gefëllt war (Waters, Katalognr. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Peptiden mat enger Duerchflussquote vun 30 μl/min trennen, vun 1% op 50% Puffer B fir 85 Minutten mat engem stufenweise Gradient vun 96 Minutten, vun 50% op 95% Puffer B fir 3 Minutten, dann 8 Minutten fir 95% Puffer B; Puffer A besteet aus 5% ACN an 10 mM Ammoniumbikarbonat (ABC), a Puffer B besteet aus 80% ACN an 10 mM ABC. Sammelt d'Fraktiounen all 3 Minutten a verbënnt se an zwou Gruppen (1 + 17, 2 + 18, etc.) an dréchent se an enger Vakuumzentrifuge.
LC-MS/MS-Analyse. Fir d'Massenspektrometrie goufen d'Peptiden (Nummer r119.aq) op enger 25 cm, 75 μm bannenzeger Duerchmiesser PicoFrit-Analyskolonn (nei Objektivlëns, Artikelnummer PF7508250) getrennt, déi mat engem 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ Medium (Dr. Maisch, mat), Use EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Däitschland) ausgestatt war. D'Kolonn gouf bei 50°C gehalen. D'Puffer A a B bestinn aus 0,1% Ameensäure a Waasser an 0,1% Ameensäure an 80% ACN. D'Peptiden goufen aus 6% op 31% Puffer B fir 65 Minutten a vun 31% op 50% Puffer B fir 5 Minutten mat engem Gradient vun 200 nl/min getrennt. Déi eluéiert Peptide goufen op engem Orbitrap Fusion Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) analyséiert. D'm/z-Miessung vum Peptid-Precursor gëtt mat enger Opléisung vun 120.000 am Beräich vun 350 bis 1500 m/z duerchgefouert. Mat 27% normaliséierter Kollisiounsenergie gëtt de stäerksten Precursor mat engem Ladungszoustand vun 2 bis 6 fir d'Spaltung vun der Héichenergie-C-Fall-Dissoziatioun (HCD) ausgewielt. D'Zykluszäit gëtt op 1 s festgeluecht. Den m/z-Wäert vum Peptidfragment gouf an der Ionenfalle gemooss mat dem klengsten AGC-Zil vun 5×104 an der maximaler Injektiounszäit vun 86 ms. No der Fragmentéierung gouf de Precursor fir 45 Sekonnen op d'dynamesch Ausgrenzungslëscht gesat. TMT-markéiert Peptiden goufen op enger 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap Kolonn (Thermo Fisher Scientific, Katalognummer 164942) getrennt, an d'Migratiounsspektre goufen op engem Orbitrap Lumos Tribrid Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) analyséiert, deen mat engem High-Field asymmetresche Welleformionen (FAIMS) Ausrüstung (Thermo Fisher Scientific) ausgestatt ass a mat zwou Kompensatiounsspannungen vun −50 an −70 V funktionéiert. MS3, deen op Basis vum Synchroniséierungsvirleefer ausgewielt gëtt, gëtt fir d'TMT-Rapport-Ionensignalmiessung benotzt. D'Peptidtrennung gouf op EASY-nLC 1200 duerchgefouert, mat enger 90% linearer Gradientenelutioun, mat enger Pufferkonzentratioun vu 6% bis 31%; Puffer A war 0,1% FA, a Puffer B war 0,1% FA an 80% ACN. Déi analytesch Kolonn gëtt bei 50°C bedriwwen. Benotzt FreeStyle (Versioun 1.6, Thermo Fisher Scientific) fir déi ursprénglech Datei no der FAIMS Kompensatiounsspannung opzedeelen.
Proteinidentifikatioun a Quantifizéierung. Mat der integréierter Andromeda-Sichmaschinn goufen déi ursprénglech Donnéeën mat MaxQuant Versioun 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) analyséiert. Zousätzlech zu de Cre-Rekombinase- a YFP-Sequenzen, déi aus Aequorea victoria gewonnen goufen, goufen och Peptidfragmentspektre no der kanonescher Sequenz an der Isoformsequenz vum Mausreferenzproteom (Proteom-ID UP000000589, erofgeluede vun UniProt am Mee 2017) gesicht. Methionin-Oxidatioun a Protein-N-terminal Acetyléierung goufen als variabel Modifikatioune festgeluecht; Cystein-Carbamoyl-Methyléierung gouf als fix Modifikatioune festgeluecht. D'Verdauungsparameter sinn op "Spezifizitéit" an "Trypsin/P" festgeluecht. Déi minimal Zuel vu Peptiden a Raséierpeptiden, déi fir d'Proteinidentifikatioun benotzt ginn, ass 1; déi minimal Zuel vun eenzegaartege Peptiden ass 0. Ënner de Konditioune vum Peptid-Kaart-Matching war d'Proteinidentifikatiounsquote 0,01. D'Optioun "Zweet Peptid" ass aktivéiert. Benotzt d'Optioun "Match between runs" fir erfollegräich Identifikatiounen tëscht verschiddenen Originaldateien ze transferéieren. Benotzt LFQ Minimum Ratio Count 1 fir Label-free Quantification (LFQ) (60). D'LFQ Intensitéit gëtt fir op d'mannst zwee gülteg Wäerter an op d'mannst enger Genotypgrupp zu all Zäitpunkt gefiltert, an extrapoléiert vun enger Normalverdeelung mat enger Breet vun 0,0,3 a beweegt sech ëm 1,8 no ënnen. Benotzt d'Perseus Computing Plattform (https://maxquant.net/perseus/) an R (https://r-project.org/) fir d'LFQ Resultater ze analyséieren. En zwee-Wee moderaten t-Test aus dem limma Software Package gouf fir d'Differenzialexpressionsanalyse benotzt (61). Explorativ Datenanalyse gëtt mat ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally a pheatmap duerchgefouert. Déi TMT-baséiert Proteomikdaten goufen mat MaxQuant Versioun 1.6.10.43 analyséiert. Sicht no réie Proteomikdaten aus der UniProt Human Proteomics Datebank, déi am September 2018 erofgeluede gouf. D'Analyse enthält de Korrekturfaktor fir d'Isotopreinheet, deen vum Hiersteller zur Verfügung gestallt gëtt. Benotzt limma an R fir d'Differenzialexpressionsanalyse. Déi ursprénglech Daten, d'Resultater vun der Datebanksich, an den Datenanalyse-Workflow an d'Resultater sinn all an der ProteomeXchange Allianz iwwer de PRIDE Partner Repository mam Datenset-Identifikator PXD019690 gespäichert.
Funktional Annotatiounen beräicheren d'Analyse. Den Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) Tool gouf benotzt fir de Räichtum vun den funktionellen Annotatiounstermen vum Datesaz no 8 Wochen ze bestëmmen (Figur 1). Kuerz gesot, d'quantitativ Proteinlëscht, déi aus der LC-MS/MS (Tandem-Massenspektrometrie) Datenanalyse kritt gouf, gëtt mat de folgende Filterkriterien benotzt: Mus musculus gëtt als Aart an Hannergrond ausgewielt, an d'Kategorie weist de vum Benjamini ugepasste P-Wäert fir eng Anreicherung vun 0,05 oder méi niddreg als signifikant. Fir dëse Grafik ginn déi fënnef Top-Iwwerschosskategorien an all Cluster baséiert op dem ugepassten P-Wäert gewisen. Mat Hëllef vum Multiple-T-Test, mat dem zweestufege lineare Boost-Programm vu Benjamini, Krieger a Yekutieli (Q = 5%), gëtt eng Zäitverlaf-Proteinexpressionsanalyse op de wichtege Kandidaten duerchgefouert, déi an all Kategorie identifizéiert goufen, an all Zeil gëtt separat analyséiert. Et ass net néideg, eng konsequent SD unzehuelen.
Fir d'Resultater vun dëser Studie mat publizéierten Datebanken ze vergläichen an e Venn-Diagramm an der Figur 1 ze generéieren, hu mir déi quantitativ Proteinlëscht mat MitoCarta 2.0 Annotatiounen (24) kombinéiert. Benotzt den Online-Tool Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) fir den Diagramm ze generéieren.
Fir detailléiert Informatiounen iwwer déi statistesch Prozeduren, déi fir d'Proteomikanalyse benotzt ginn, kuckt w.e.g. déi entspriechend Sektioun "Materialien a Methoden". Fir all aner Experimenter fannt Dir detailléiert Informatiounen an der entspriechender Legend. Wann net anescht uginn, ginn all Donnéeën als Mëttelwäert ± SEM ausgedréckt, an all statistesch Analysen goufen mat der GraphPad Prism 8.1.2 Software duerchgefouert.
Fir zousätzlech Materialien zu dësem Artikel, kuckt w.e.g. http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Dëst ass en Open-Access-Artikel, deen ënner de Bedéngunge vun der Creative Commons Attribution-Non-Commercial Lizenz verdeelt gëtt, déi d'Benotzung, d'Verdeelung an d'Reproduktioun an all Medium erlaabt, soulaang déi lescht Notzung net fir kommerzielle Gewënn ass an d'Viraussetzung ass, datt d'Originalwierk korrekt ass. Referenz.
Bemierkung: Mir froen Iech nëmmen Är E-Mailadress unzeginn, fir datt déi Persoun, déi Dir op der Säit recommandéiert, weess, datt Dir wëllt, datt si d'E-Mail gesäit an datt et kee Spam ass. Mir wäerten keng E-Mailadressen ophuelen.
Dës Fro gëtt benotzt fir ze testen ob Dir e Besucher sidd an automatesch Spam-Sendung ze verhënneren.
Vun E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomik-Analyse vun dysfunktionellen Neuronen huet gewisen, datt metabolesch Programmer aktivéiert ginn, fir d'Neurodegeneratioun entgéintzewierken.
Vun E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomik-Analyse vun dysfunktionellen Neuronen huet gewisen, datt metabolesch Programmer aktivéiert ginn, fir d'Neurodegeneratioun entgéintzewierken.
©2020 American Association for the Advancement of Science. all Rechter reservéiert. AAAS ass e Partner vun HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.