Merci fir Äre Besuch op Nature.com. D'Versioun vum Browser, déi Dir benotzt, huet limitéiert CSS-Ënnerstëtzung. Fir déi bescht Resultater empfeelen mir Iech, eng méi nei Versioun vun Ärem Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten). An der Zwëschenzäit, fir déi weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, weisen mir d'Websäit ouni Styling oder JavaScript.
Propionsäure (PPA) gëtt benotzt fir d'Roll vun der mitochondrialer Dysfunktioun bei neuroentwécklungsstéierungen, wéi zum Beispill Autismus-Spektrum-Stéierungen, ze studéieren. Et ass bekannt, datt PPA d'Biogenese, de Metabolismus an den Turnover vun der mitochondrialer Zell stéiert. Wéi och ëmmer, bleiwen d'Effekter vu PPA op d'mitochondrialen Dynamik, d'Fissioun an d'Fusioun problematesch wéinst der komplexer zäitlecher Natur vun dëse Mechanismen. Hei benotze mir komplementär quantitativ Bildgebungstechniken fir z'ënnersichen, wéi PPA d'mitochondrialen Ultrastruktur, d'Morphologie an d'Dynamik an neuron-änlechen SH-SY5Y Zellen beaflosst. PPA (5 mM) huet eng bedeitend Reduktioun vun der mitochondrialen Fläch (p < 0,01), dem Duerchmiesser an dem Ëmfang vum Frett (p < 0,05) a Fläch 2 (p < 0,01) verursaacht. D'Analyse vum mitochondrial Event Locator huet eng bedeitend Erhéijung (p < 0,05) vun de Fissiouns- an Fusiounsereignisser gewisen, wouduerch d'Integritéit vum mitochondrialen Netzwierk ënner Stressbedingungen erhale bliwwen ass. Zousätzlech war d'mRNA-Expressioun vu cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) an OPA1 (p < 0,05) däitlech reduzéiert. 01). Dëst illustréiert d'Remodeling vun der mitochondrialer Morphologie, Biogenese an Dynamik fir d'Funktioun ënner Stressbedingungen z'erhalen. Eis Donnéeën bidden nei Abléck an d'Auswierkunge vun der PPA op d'mitochondrialer Dynamik a beliichten d'Nëtzlechkeet vun Imaging-Techniken fir d'Studium vun de komplexe Reguléierungsmechanismen, déi a mitochondrialer Stressreaktiounen involvéiert sinn.
Mitochondrien spillen integral Rollen an enger Villfalt vu Zellfunktiounen, déi iwwer hir typesch Rollen an der Energieproduktioun a Biosynthese erausginn. De mitochondriale Metabolismus ass e Schlësselregulator vun der Kalziumsignalgebung, der metabolescher an Redox-Homöostase, der entzündlecher Signalgebung, epigenetischen Modifikatiounen, Zellproliferatioun, Differenzéierung a programméiertem Zelltod1. Besonnesch de mitochondriale Metabolismus ass entscheedend fir d'Entwécklung, d'Iwwerliewe an d'Funktioun vun den Neuronen a gëtt wäit verbreet a verschiddene Manifestatioune vun der Neuropathologie2,3,4 involvéiert.
An de leschten zéng Joer huet sech de metabolesche Status als zentralen Reguléierer vun der Neurogenese, der Differenzéierung, der Reifung an der Plastizitéit erausgestallt5,6. An der leschter Zäit sinn d'Mitochondrialmorphologie an d'Dynamik besonnesch wichteg Komponenten vun der Mitose ginn, engem dynamesche Prozess, deen e Pool vu gesonde Mitochondrien an den Zellen erhalen. D'Mitochondrialdynamik gëtt duerch komplex, ofhängeg Weeër reguléiert, déi vun der mitochondrialer Biogenese a Bioenergetik bis zur mitochondrialer Spaltung, Fusioun, Transport a Clearance7,8 reechen. Eng Stéierung vun engem vun dësen integrativen Mechanismen beeinträchtigt d'Erhalen vu gesonde mitochondrialen Netzwierker an huet déifgräifend funktionell Konsequenze fir d'Neuroentwécklung9,10. Tatsächlech gëtt eng Dysreguléierung vun der mitochondrialer Dynamik a ville psychiatreschen, neurodegenerativen an neuroentwécklungsstéierungen, dorënner Autismus-Spektrum-Stéierungen (ASS)11,12 observéiert.
ASD ass eng heterogen neuroentwécklungsstéierung mat enger komplexer genetescher an epigenetescher Architektur. D'Ierflechkeet vun ASD ass onbestridden, awer déi zugronnleeënd molekular Etiologie bleift schlecht verstanen. D'Sammlung vun Donnéeën aus präklineschen Modeller, klineschen Studien a multi-omics molekulare Datensätz liwwert ëmmer méi Beweiser fir mitochondrial Dysfunktioun bei ASD13,14. Mir hunn virdru e genomwäit DNA-Methylierungsscreening an enger Kohort vu Patienten mat ASD duerchgefouert an differentiell methyléiert Genen identifizéiert, déi laanscht mitochondrial metabolesch Weeër geclustert sinn15. Mir hunn duerno eng differentiell Methylierung vun zentralen Reguléierer vun der mitochondrialer Biogenese an Dynamik gemellt, déi mat enger erhéichter mtDNA-Kopiezuel an engem verännerten Urinmetabolismusprofil bei ASD16 assoziéiert war. Eis Donnéeë liwweren ëmmer méi Beweiser dofir, datt mitochondrial Dynamik an Homöostase eng zentral Roll an der Pathophysiologie vun ASD spillen. Dofir ass d'Verbesserung vum mechanistesche Verständnis vun der Bezéiung tëscht mitochondrialer Dynamik, Morphologie a Funktioun e Schlësselzil vun der lafend Fuerschung iwwer neurologesch Krankheeten, déi duerch sekundär mitochondrial Dysfunktioun charakteriséiert sinn.
Molekular Technike ginn dacks benotzt fir d'Roll vu spezifesche Genen a mitochondriale Stressreaktiounen ze studéieren. Dësen Usaz kann awer duerch déi villfälteg an zäitlech Natur vu mitotische Kontrollmechanismen limitéiert sinn. Ausserdeem ass déi differenziell Expressioun vu mitochondriale Genen en indirekten Indikator fir funktionell Ännerungen, besonnesch well typescherweis nëmmen eng limitéiert Zuel vu Genen analyséiert gëtt. Dofir goufen méi direkt Methoden fir d'Studium vun der mitochondrialer Funktioun a Bioenergetik proposéiert17. D'mitochondrial Morphologie ass enk mat der mitochondrialer Dynamik verbonnen. Mitochondrial Form, Konnektivitéit a Struktur si kritesch fir d'Energieproduktioun an d'Mitochondrien- an Zelliwwerliewe5,18. Ausserdeem konzentréiere sech déi verschidde Komponenten vun der Mitose op Ännerungen an der mitochondrialer Morphologie, déi als nëtzlech Endpunkte vun der mitochondrialer Dysfunktioun dénge kënnen an eng Basis fir spéider mechanistesch Studien ubidden.
D'Mitochondriemorphologie kann direkt mat Hëllef vun der Transmissiounselektronemikroskopie (TEM) observéiert ginn, wat eng detailléiert Studie vun der zellularer Ultrastruktur erméiglecht. TEM visualiséiert direkt d'Morphologie, d'Form an d'Struktur vu mitochondrialen Cristae bei der Opléisung vun eenzelne Mitochondrien, anstatt sech eleng op Gentranskriptioun, Proteinexpression oder mitochondrial funktionell Parameteren an Zellpopulatiounen ze verloossen17,19,20. Zousätzlech erliichtert TEM d'Studie vun den Interaktiounen tëscht Mitochondrien an aneren Organellen, wéi dem endoplasmatesche Retikulum an Autophagosomen, déi Schlësselrollen an der mitochondrierfunktioun an Homöostase spillen21,22. Dofir ass TEM zu engem gudden Ausgangspunkt fir d'Studie vun der mitochondrieller Dysfunktioun, ier een sech op spezifesch Weeër oder Genen konzentréiert. Well d'Mitochondriefunktioun ëmmer méi relevant fir d'Neuropathologie gëtt, gëtt et e kloert Besoin, d'mitochondrial Morphologie an Dynamik direkt a quantitativ an in vitro neuronalen Modeller ze studéieren.
An dësem Artikel ënnersiche mir d'mitochondrial Dynamik an engem neuronalen Modell vun der mitochondrialer Dysfunktioun bei Autismus-Spektrum-Stéierungen. Mir hunn virdru schonn iwwer déi differentiell Methylierung vun der Propionyl-CoA-Carboxylase Beta (PCCB) an ASD15 bericht, enger Ënnereenheet vum mitochondrialem Propionyl-CoA-Carboxylase-Enzym PCC. Et ass bekannt, datt Dysreguléierung vum PCC eng toxesch Akkumulatioun vu Propionylderivater verursaacht, dorënner Propionsäure (PPA)23,24,25. Et gouf gewisen, datt PPA den neuronalen Metabolismus stéiert an d'Verhalen in vivo verännert an ass en etabléiert Déiermodell fir d'Studie vun den neuroentwécklungsmechanismen, déi an ASD involvéiert sinn26,27,28. Zousätzlech gouf bericht, datt PPA de mitochondrialen Membranpotenzial, d'Biogenese an d'Atmung in vitro stéiert a gouf wäit verbreet benotzt fir mitochondrial Dysfunktioun an Neuronen ze modelléieren29,30. Den Impakt vun der PPA-induzéierter mitochondrialer Dysfunktioun op d'mitochondrial Morphologie an Dynamik ass awer nach ëmmer schlecht verstanen.
Dës Studie benotzt komplementär Bildgebungstechniken fir d'Effekter vum PPA op d'mitochondrial Morphologie, Dynamik a Funktioun an SH-SY5Y Zellen ze quantifizéieren. Als éischt hu mir eng TEM-Method entwéckelt fir Ännerungen an der mitochondrialer Morphologie an Ultrastruktur ze visualiséieren17,31,32. Wéinst der dynamescher Natur vun de Mitochondrien33 hu mir och d'MEL-Analyse (Mitochondrial Event Localizer) benotzt fir Ännerungen am Gläichgewiicht tëscht Spaltungs- an Fusiounsevenementer, der Mitochondrienzuel an dem Volumen ënner PPA-Stress ze quantifizéieren. Schlussendlech hu mir ënnersicht ob d'mitochondrial Morphologie an Dynamik mat Ännerungen an der Expressioun vu Genen verbonne sinn, déi an der Biogenese, Spaltung a Fusioun involvéiert sinn. Zesummegeholl illustréieren eis Donnéeën d'Erausfuerderung, d'Komplexitéit vun de Mechanismen ze klären, déi d'mitochondrial Dynamik reguléieren. Mir ënnersträichen den Notzen vum TEM bei der Studie vun der mitochondrialer Morphologie als e messbare konvergenten Endpunkt vun der Mitose an SH-SY5Y Zellen. Zousätzlech ënnersträiche mir, datt TEM-Donnéeën déi räichst Informatioun liwweren, wa se mat Bildgebungstechniken kombinéiert ginn, déi och dynamesch Evenementer als Äntwert op metabolescht Stress erfassen. Eng weider Charakteriséierung vun de molekulare Reguléierungsmechanismen, déi d'Mitose vun der neuronaler Zell ënnerstëtzen, kéint wichteg Abléck an d'mitochondrial Komponent vum Nervensystem an neurodegenerativ Krankheeten ginn.
Fir mitochondriale Stress ze induzéieren, goufen SH-SY5Y Zellen mat PPA mat 3 mM an 5 mM Natriumpropionat (NaP) behandelt. Virun der TEM goufen d'Prouwe kryogener Proufvirbereedung mat Hëllef vun Héichdrock-Gefrierung a Gefrierung ënnerworf (Fig. 1a). Mir hunn eng automatiséiert Pipeline fir d'Analyse vu mitochondrialem Bild entwéckelt, fir aacht morphologesch Parameter vu Mitochondrienpopulatiounen iwwer dräi biologesch Replikater ze moossen. Mir hunn festgestallt, datt d'PPA-Behandlung véier Parameter signifikant geännert huet: Fläch 2, Fläch, Perimeter a Feret-Duerchmiesser (Fig. 1b-e). Fläch 2 ass souwuel mat 3 mM wéi och mat 5 mM PPA-Behandlung signifikant erofgaangen (p = 0,0183 a p = 0,002) (Fig. 1b), während d'Fläch (p = 0,003), de Perimeter (p = 0,0106) an de Feret-Duerchmiesser all signifikant erofgaange sinn. Et gouf eng signifikant Reduktioun (p = 0,0172) an der 5 mM Behandlungsgrupp am Verglach mat der Kontrollgrupp (Fig. 1c-e). Signifikant Reduktiounen an der Fläch an dem Ëmfang hunn gewisen, datt Zellen, déi mat 5 mM PPA behandelt goufen, méi kleng, méi gerundet Mitochondrien haten, an datt dës Mitochondrien manner verlängert waren wéi déi an de Kontrollzellen. Dëst ass och konsequent mat enger bedeitender Ofsenkung vum Feret-Duerchmiesser, en onofhängege Parameter, deen eng Ofsenkung vum gréissten Ofstand tëscht de Partikelkanten ugeet. Ännerungen an der Ultrastruktur vun de Cristae goufen observéiert: d'Cristae goufe manner ausgeprägt ënner dem Afloss vum PPA-Stress (Fig. 1a, Panel B). Wéi och ëmmer, net all Biller hunn d'Ultrastruktur vun de Cristae kloer reflektéiert, sou datt keng quantitativ Analyse vun dësen Ännerungen duerchgefouert gouf. Dës TEM-Donnéeë kënnen dräi méiglech Szenarie reflektéieren: (1) PPA verbessert d'Spaltung oder hemmt d'Fusioun, wouduerch existent Mitochondrien an der Gréisst schrumpfen; (2) eng verstäerkt Biogenese erstellt nei, méi kleng Mitochondrien oder (3) induzéiert béid Mechanismen gläichzäiteg. Och wann dës Konditioune net duerch TEM ënnerscheet kënne ginn, weisen bedeitend morphologesch Ännerungen op Ännerungen an der mitochondrialer Homöostase an Dynamik ënner PPA-Stress hin. Mir hunn duerno zousätzlech Parameteren ënnersicht, fir dës Dynamik an déi potenziell Mechanismen, déi hinnen zugronn leien, weider ze charakteriséieren.
Propionsäure (PPA) remodelléiert d'Mitochondrienmorphologie. (a) Representativ Transmissiounselektronemikroskopie (TEM) Biller, déi weisen, datt d'Gréisst vun der Mitochondrie ofhëlt an d'Mitochondrien mat zunehmender PPA-Behandlung méi kleng a méi gerundet ginn; 0 mM (onbehandelt), 3 mM a 5 mM, respektiv. Rout Pfeiler weisen Mitochondrien un. (b-e) SH-SY5Y Zellen, déi 24 Stonnen mat PPA behandelt goufen, goufen fir TEM virbereet an d'Resultater goufen mat Fiji/ImageJ analyséiert. Véier vun den aacht Parameteren hunn signifikant Ënnerscheeder tëscht Kontroll- (onbehandelt, 0 mM PPA) a behandelten (3 mM a 5 mM PPA) Zellen gewisen. (b) Regioun 2, (c) Fläch, (d) Perimeter, (e) Duerchmiesser vum Frettchen. Eng Een-Wee-Varianzanalyse (Kontroll vs. Behandlung) an den Dunnett-Multiple-Vergläichstest goufen benotzt fir signifikant Ënnerscheeder ze bestëmmen (p < 0,05). D'Datepunkte representéieren den duerchschnëttleche Mitochondrienwäert fir all eenzel Zell, an d'Feelerbalken representéieren de Mittelwert ± SEM. Déi gewisen Donnéeën representéieren n = 3, op d'mannst 24 Zellen pro Widderhuelung; insgesamt 266 Biller goufen analyséiert; * weist p < 0,05 un, ** weist p < 0,01 un.
Fir weider ze charakteriséieren, wéi d'Mitochondriendynamik op PPA reagéiert, hu mir Mitochondrien mat Tetramethylrhodaminethylester (TMRE) gefierft an Zäitlafmikroskopie an MEL-Analyse benotzt, fir Mitochondrien no 24 Stonnen bei 3 an 5 mM PPA ze lokaliséieren a quantifizéieren. Behandlung vu Spaltungs- a Fusiounsereignisser. (Fig. 2a). No der MEL-Analyse goufen d'Mitochondrien weider analyséiert, fir d'Zuel vun de mitochondrialen Strukturen an hiren duerchschnëttleche Volumen ze quantifizéieren. Mir hunn eng kleng awer bedeitend Erhéijung vun der Zuel vun de Spaltungsereignisser bei 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] am Verglach zu Spaltungs- [5,6 ± 0,3 (p < 0,05))] a Fusiouns- [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] a Fusiouns- [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] observéiert, ware bei 5 mM am Verglach zur Kontroll signifikant erhéicht (Fig. 3b). D'Zuel vun de Mitochondrien ass souwuel bei 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] wéi och bei 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Fig. 3c) däitlech eropgaang, während den Duerchschnëttsvolumen vun all Mitochondrienstruktur onverännert bliwwen ass (Fig. 3c). 3d). Zesummegeholl weist dat drop hin, datt d'Remodeling vun der Mitochondriendynamik als eng kompensatoresch Äntwert déngt, déi d'Integritéit vum Mitochondriennetz erfollegräich erhalen. D'Erhéijung vun der Zuel vun de Spaltungsereignisser bei 3 mM PPA weist drop hin, datt d'Erhéijung vun der Mitochondrienzuel deelweis op d'Mitochondrienspaltung zréckzeféieren ass, awer well den duerchschnëttleche Mitochondrienvolumen am Wesentlechen onverännert bleift, kann d'Biogenese net als zousätzlech kompensatoresch Äntwert ausgeschloss ginn. Dës Donnéeën entspriechen awer de méi klenge, ronne Mitochondrienstrukturen, déi duerch TEM observéiert goufen, a weisen och bedeitend Ännerungen an der Mitochondriendynamik, déi duerch PPA induzéiert ginn.
Propionsäure (PPA) induzéiert dynamesch mitochondrial Remodeling fir d'Netzwierkintegritéit ze erhalen. SH-SY5Y Zellen goufen kultivéiert, mat 3 an 5 mM PPA fir 24 Stonnen behandelt a mat TMRE an Hoechst 33342 gefierft, gefollegt vun enger MEL-Analyse. (a) Representativ Zäitlaf-Mikroskopiebiller, déi Faarf a binäriséiert maximal Intensitéitsprojektiounen zum Zäitpunkt 2 (t2) fir all Konditioun weisen. Ausgewielte Regiounen, déi an all binäre Bild ugewise sinn, ginn verbessert an an 3D zu dräi verschiddenen Zäitrahmen (t1-t3) ugewise fir d'Dynamik iwwer d'Zäit ze illustréieren; Fusiounsereignisser sinn a gréng markéiert; Spaltungsereignisser sinn a gréng markéiert. A rout ugewise. (b) Duerchschnëttlech Zuel vun dynameschen Eventer pro Konditioun. (c) Duerchschnëttlech Zuel vu mitochondrialen Strukturen pro Zell. (d) Duerchschnëttsvolumen (µm3) vun all mitochondrialen Struktur pro Zell. Déi ugewise Donnéeën si representativ fir n = 15 Zellen pro Behandlungsgrupp. Déi ugewise Feelerbalken representéieren de Mittelwäert ± SEM, Skalabalk = 10 μm, * p < 0,05.
Propionsäure (PPA) verursaacht d'Transkriptiounsënnerdréckung vu Genen, déi mat der mitochondrialer Dynamik assoziéiert sinn. SH-SY5Y Zellen goufen 24 Stonnen mat 3 an 5 mM PPA behandelt. Relativ Genquantifizéierung gouf mat RT-qPCR duerchgefouert an op B2M normaliséiert. Mitochondrial Biogenese Genen (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 an (d) NFE2L2. Mitochondrial Fusiouns- a Spaltungsgenen (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 an (i) DRP1. Signifikant Ënnerscheeder (p < 0,05) goufen mat One-Way ANOVA (Kontroll vs. Behandlung) an dem Dunnett Multiple Comparison Test getest: * weist p < 0,05 un, ** weist p < 0,01 un, an **** weist p < 0,0001 un. D'Balken representéieren déi duerchschnëttlech Expressioun ± SEM. Déi gewisen Donnéeën representéieren biologesch Replikater vun n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) an n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1).
D'Donnéeë vun den TEM- an MEL-Analysen zesummen weisen drop hin, datt PPA d'Mitochondrialmorphologie an d'Dynamik verännert. Dës Bildgebungstechnike bidden awer keen Abléck an déi zugronnleeënd Mechanismen, déi dës Prozesser untreiwen. Mir hunn dofir d'mRNA-Expressioun vun néng Schlësselregulatoren vun der Mitochondrialdynamik, der Biogenese an der Mitose als Äntwert op d'PPA-Behandlung ënnersicht. Mir hunn den Zellmyelomonkogen (cMYC), den nuklearen Atmungsfaktor (NRF1), den mitochondrialen Transkriptiounsfaktor 1 (TFAM), den NFE2-ähnlechen Transkriptiounsfaktor BZIP (NFE2L2), den Gastrin-ähnlechen Protein 2 (STOML2), d'Atrophie vum Sehnerv 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) an den Dynamin-related protein 1 (DRP1) no 24 Stonne Behandlung mat 3 mM an 5 mM PPA quantifizéiert. Mir hunn eng PPA-Behandlung mat 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 a p < 0,0001) a 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) observéiert. (Fig. 3a-c). D'Ofsenkung vun der mRNA-Expressioun war dosisofhängeg: d'Expressioun vu cMYC, NRF1 an TFAM ass ëm d'5,7-, 2,6- an 1,9-Fach bei 3 mM respektiv an ëm d'11,2-, 3- an 2,2-Fach bei 5 mM erofgaang. Am Géigesaz dozou huet sech den zentralen Redox-Biogenese-Gen NFE2L2 bei kenger PPA-Konzentratioun verännert, obwuel eng ähnlech dosisofhängeg Tendenz vun enger erofgaangener Expressioun observéiert gouf (Fig. 3d).
Mir hunn och d'Expressioun vu klassesche Genen ënnersicht, déi an der Reguléierung vun der Spaltung a Fusioun involvéiert sinn. Et gëtt ugeholl, datt STOML2 un der Fusioun, der Mitophagie an der Biogenese involvéiert ass, a seng Expressioun war signifikant reduzéiert (p < 0,0001) ëm 3 mM (2,4-fache Ännerung) a 5 mM (2,8-fache Ännerung) PPA (Fig. 1). 3d). Ähnlech war d'OPA1-Fusiounsgenexpressioun bei 3 mM (1,6-fache Ännerung) a 5 mM (1,9-fache Ännerung) PPA (p = 0,006 bzw. p = 0,0024) erofgaang (Fig. 3f). Mir hunn awer keng signifikant Ënnerscheeder an der Expressioun vun de Fusiounsgenen MFN1, MFN2 oder dem Spaltungsgen DRP1 ënner 24-Stonne PPA-Stress fonnt (Fig. 3g-i). Zousätzlech hu mir festgestallt, datt d'Niveaue vu véier Fusiouns- a Spaltungsproteinen (OPA1, MFN1, MFN2 an DRP1) sech net ënner de selwechte Konditioune geännert hunn (Fig. 4a-d). Et ass wichteg ze bemierken, datt dës Donnéeën een eenzegen Zäitpunkt reflektéieren a vläicht net d'Ännerungen an der Proteinexpression oder den Aktivitéitsniveauen während de fréie Stadien vum PPA-Stress reflektéieren. Wéi och ëmmer, bedeitend Reduktiounen an der Expression vu cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 an OPA1 weisen op eng bedeitend transkriptionell Dysreguléierung vum mitochondriale Metabolismus, der Biogenese an der Dynamik hin. Zousätzlech ënnersträichen dës Donnéeën d'Nëtzlechkeet vun Imaging-Techniken fir direkt Ännerungen am Endzoustand vun der mitochondrialer Funktioun ze studéieren.
D'Fusiouns- a Spaltungsfaktorproteinniveauen hunn sech no der Behandlung mat Propionsäure (PPA) net geännert. SH-SY5Y-Zellen goufen 24 Stonnen mat 3 an 5 mM PPA behandelt. D'Proteinniveauen goufen duerch Western-Blot-Analyse quantifizéiert, an d'Expressiounsniveauen goufen op d'Gesamtprotein normaliséiert. Duerchschnëttlech Proteinexpressioun a representativ Western-Blots vum Zil- a Gesamtprotein ginn ugewisen. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. D'Balke representéieren de Moyenne ± SEM, an déi ugewise Daten si representativ fir n = 3 biologesch Replikater. Multiple Vergläicher (p < 0,05) goufen mat Hëllef vun der One-Way-Varianzanalyse an dem Dunnett-Test duerchgefouert. Den urspréngleche Gel an de Blot sinn an der Figur S1 gewisen.
Mitochondrial Dysfunktioun gëtt mat multisystem Krankheeten assoziéiert, déi vu metaboleschen, kardiovaskulären a muskulaturen Krankheeten bis zu neurologesche Krankheeten reechen1,10. Vill neurodegenerativ an neurodegenerativ Krankheeten si mat mitochondrialer Dysfunktioun assoziéiert, wat d'Wichtegkeet vun dësen Organellen am ganze Liewensdauer vum Gehir ënnersträicht. Zu dëse Krankheeten gehéieren Parkinson, Alzheimer an ASD3,4,18. Wéi och ëmmer, den Zougang zu Gehirgewebe fir dës Krankheeten ze studéieren ass schwéier, besonnesch op der mechanistescher Ebene, wouduerch Zellmodellsystemer eng néideg Alternativ sinn. An dëser Studie benotze mir e Zellmodellsystem mat PPA-behandelte SH-SY5Y Zellen fir déi mitochondrial Dysfunktioun ze rekapituléieren, déi bei neuronalen Krankheeten, besonnesch Autismus-Spektrum Stéierungen, observéiert gëtt. D'Benotzung vun dësem PPA-Modell fir d'Mitochondriendynamik an Neuronen ze studéieren kéint Abléck an d'Etiologie vun ASD ginn.
Mir hunn d'Méiglechkeet ënnersicht, TEM ze benotzen, fir Ännerungen an der mitochondrialer Morphologie ze gesinn. Et ass wichteg ze bemierken, datt TEM richteg benotzt muss ginn, fir seng Effizienz ze maximéieren. D'Virbereedung vu Kryo-Prouwe erméiglecht eng besser Erhaalung vun neuronalen Strukturen, andeems d'zellulär Komponenten gläichzäiteg fixéiert ginn an d'Bildung vun Artefakten reduzéiert gëtt34. Am Aklang domat hu mir observéiert, datt neuronähnlech SH-SY5Y Zellen intakt subzellulär Organellen an verlängert Mitochondrien haten (Fig. 1a). Dëst ënnersträicht d'Nëtzlechkeet vu kryogenen Virbereedungstechniken fir d'Studium vun der mitochondrialer Morphologie an neuronalen Zellmodeller. Och wann quantitativ Miessunge fir d'objektiv Analyse vun TEM-Daten entscheedend sinn, gëtt et nach ëmmer kee Konsens doriwwer, wéi eng spezifesch Parameter gemooss solle ginn, fir mitochondrial morphologesch Ännerungen ze bestätegen. Baséierend op enger grousser Zuel vu Studien, déi d'mitochondrial Morphologie quantitativ ënnersicht hunn17,31,32, hu mir eng automatiséiert mitochondrial Bildanalysepipeline entwéckelt, déi aacht morphologesch Parameter moosst, nämlech: Fläch, Fläch2, Aspektverhältnis, Perimeter, Kreisform, Grad, Feret-Duerchmiesser a Ronnheet.
Dorënner huet PPA d'Fläch 2, d'Fläch, de Perimeter an den Duerchmiesser vum Feret däitlech reduzéiert (Fig. 1b-e). Dëst huet gewisen, datt d'Mitochondrien méi kleng a méi gerundet goufen, wat mat fréiere Studien iwwereneestëmmt, déi eng Ofsenkung vun der Mitochondrienfläch no 72 Stonne PPA30-induzéiertem mitochondriale Stress gewisen hunn. Dës morphologesch Charakteristike kënnen op eng mitochondrial Spaltung hiweisen, e néidege Prozess fir beschiedegt Komponenten aus dem mitochondrialen Netzwierk ze sequestréieren, fir hiren Degradatioun duerch Mitophagie35,36,37 ze fërderen. Op der anerer Säit kann d'Ofsenkung vun der duerchschnëttlecher Mitochondriengréisst mat enger erhéichter Biogenese verbonne sinn, wat zu der Bildung vu klenge nascenten Mitochondrien féiert. Eng erhéicht Spaltung oder Biogenese stellt eng kompensatoresch Äntwert duer, fir d'Mitose géint mitochondrialen Stress z'erhalen. Wéi och ëmmer, e reduzéierte Mitochondrienwuesstum, eng behënnert Fusioun oder aner Konditioune kënnen net ausgeschloss ginn.
Obwuel d'Biller mat héijer Opléisung, déi mat TEM erstallt ginn, d'Bestimmung vu morphologesche Charakteristiken op der Ebene vun den eenzelne Mitochondrien erlaben, produzéiert dës Method zweedimensional Schnappschëss zu engem eenzegen Zäitpunkt. Fir dynamesch Reaktiounen op metabolesche Stress ze studéieren, hu mir Mitochondrien mat TMRE gefierft an Zäitlafmikroskopie mat MEL-Analyse benotzt, déi eng héichduerchsiichteg 3D-Visualiséierung vu Verännerungen am mitochondrialen Netzwierk iwwer Zäit erméiglecht33,38. Mir hunn subtil awer bedeitend Verännerungen an der mitochondrialen Dynamik ënner PPA-Stress observéiert (Fig. 2). Bei 3 mM ass d'Zuel vun de Spaltungsereignisser signifikant eropgaang, während d'Fusiounsereignisser d'selwecht bliwwe sinn wéi an der Kontroll. Eng Erhéijung vun der Zuel vu souwuel Spaltungs- wéi och Fusiounsereignisser gouf bei 5 mM PPA observéiert, awer dës Verännerunge ware ongeféier proportional, wat drop hiweist, datt d'Spaltungs- a Fusiounskinetik bei méi héije Konzentratioune Gläichgewiicht erreecht (Fig. 2b). Dat duerchschnëttlecht mitochondrial Volumen ass souwuel bei 3 wéi och bei 5 mM PPA onverännert bliwwen, wat drop hiweist, datt d'Integritéit vum mitochondrialen Netzwierk erhale bliwwen ass (Fig. 2d). Dëst reflektéiert d'Fäegkeet vun dynamesche mitochondrialen Netzwierker, op liichte metabolesche Stress ze reagéieren, fir effektiv d'Homöostase z'erhalen, ouni d'Netzwierkfragmentatioun ze verursaachen. Bei 3 mM PPA ass d'Erhéijung vun der Spaltung ausräichend fir den Iwwergank zu engem neie Gläichgewiicht ze fërderen, awer eng méi déifgräifend kinetesch Remodeling ass als Äntwert op Stress erfuerderlech, deen duerch méi héich Konzentratioune vu PPA induzéiert gëtt.
D'Zuel vun de Mitochondrien ass bei béide PPA-Stresskonzentratioune geklommen, awer dat duerchschnëttlecht Mitochondrienvolumen huet sech net signifikant geännert (Fig. 2c). Dëst kéint op eng erhéicht Biogenese oder eng erhéicht Deelung zréckzeféieren sinn; awer wann et keng bedeitend Ofsenkung vum duerchschnëttleche Mitochondrienvolumen gëtt, ass et méi wahrscheinlech, datt d'Biosynthese zouhëlt. D'Donnéeën an der Figur 2 ënnerstëtzen awer d'Existenz vun zwéi Kompensatiounsmechanismen: eng Erhéijung vun der Zuel vun de Spaltungsereignisser, déi mat der Upreguléierung vun der mitochondrialer Spaltung konsequent sinn, an eng Erhéijung vun der Zuel vun den Ereignisser, déi mat der mitochondrialer Biogenese konsequent sinn. Schlussendlech kann déi dynamesch Kompensatioun fir liichte Stress aus simultane Prozesser bestoen, déi Spaltung, Fusioun, Biogenese a Mitophagie involvéieren. Och wann fréier Autoren gewisen hunn, datt PPA d'Mitose30,39 an d'Mitophagie29 verbessert, liwwere mir Beweiser fir d'Remodeling vun der mitochondrialer Spaltungs- a Fusiounsdynamik als Äntwert op PPA. Dës Donnéeën bestätegen déi morphologesch Verännerungen, déi vum TEM observéiert goufen, a ginn weider Abléck an d'Mechanismen, déi mat PPA-induzéierter mitochondrialer Dysfunktioun verbonne sinn.
Well weder d'TEM- nach d'MEL-Analyse direkt Beweiser fir d'Genreguléierungsmechanismen geliwwert huet, déi den observéierte morphologesche Verännerungen zugronn leien, hu mir d'RNA-Expressioun vu Genen ënnersicht, déi am mitochondriale Metabolismus, der Biogenese an der Dynamik involvéiert sinn. De cMYC-Proto-Onkogen ass en Transkriptiounsfaktor, deen an der Reguléierung vun der Mitochondrien, der Glykolyse, dem Aminosäure- a Fettsäuremetabolismus involvéiert ass40. Zousätzlech ass bekannt, datt cMYC d'Expressioun vu bal 600 mitochondriale Genen reguléiert, déi an der mitochondrialer Transkriptioun, Translatioun a Komplexassembléierung involvéiert sinn, dorënner NRF1 an TFAM41. NRF1 an TFAM sinn zwee zentral Reguléierer vun der Mitose, déi no PGC-1α wierken, fir d'mtDNA-Replikatioun z'aktivéieren. Dëse Signalwee gëtt duerch cAMP- an AMPK-Signalgebung aktivéiert an ass empfindlech fir Energieverbrauch a metabolesche Stress. Mir hunn och NFE2L2, e Redoxregulator vun der mitochondrialer Biogenese, ënnersicht, fir ze bestëmmen, ob d'Effekter vum PPA duerch oxidativen Stress vermittelt kënne ginn.
Obwuel d'NFE2L2-Expressioun onverännert bliwwen ass, hu mir eng konsequent dosisofhängeg Ofsenkung vun der Expressioun vu cMYC, NRF1 an TFAM no 24 Stonne Behandlung mat 3 mM an 5 mM PPA festgestallt (Fig. 3a-c). Eng Downreguléierung vun der cMYC-Expressioun gouf virdru als Äntwert op mitochondriale Stress gemellt42, an am Géigendeel kann eng Downreguléierung vun der cMYC-Expressioun mitochondrial Dysfunktioun verursaachen andeems se de mitochondriale Metabolismus, d'Netzwierkverbindung an d'Membranpolariséierung43 remodelléiert. Interessanterweis ass cMYC och un der Reguléierung vun der mitochondrialer Spaltung a Fusioun42,43 bedeelegt a bekannt ass fir d'DRP1-Phosphoryléierung an d'mitochondrial Lokaliséierung während der Zelldeelung44 ze erhéijen, souwéi de mitochondriale morphologesche Remodelling an neuronalen Stammzellen45 ze vermëttelen. Tatsächlech weisen cMYC-defizient Fibroblasten eng reduzéiert Mitochondriengréisst op, wat mat de Verännerungen iwwer PPA43-Stress konsequent ass. Dës Donnéeën illustréieren eng interessant, awer nach net kloer Bezéiung tëscht cMYC an der mitochondrialer Dynamik a bidden en interessant Zil fir zukünfteg Studien iwwer PPA-Stress-induzéierte Remodelling.
D'Reduktioun vun NRF1 an TFAM ass konsequent mat der Roll vu cMYC als wichtegen Transkriptiounsaktivator. Dës Donnéeën sinn och konsequent mat fréiere Studien u mënschleche Colonkriibszellen, déi weisen datt PPA d'NRF1 mRNA-Expressioun no 22 Stonnen reduzéiert huet, wat mat ATP-Depletioun an enger Erhéijung vun ROS46 assoziéiert war. Dës Autoren hunn och bericht, datt d'TFAM-Expressioun no 8,5 Stonnen eropgaangen ass, awer no 22 Stonnen op den Ausgangsniveau zréckgaangen ass. Am Géigesaz dozou hunn de Kim et al. (2019) gewisen, datt d'TFAM mRNA-Expressioun no 4 Stonne PPA-Stress an SH-SY5Y-Zellen signifikant erofgaangen ass; awer no 72 Stonnen war d'TFAM-Proteinexpressioun signifikant eropgaangen an d'mtDNA-Kopiezuel signifikant eropgaangen. Dofir schléisst d'Reduktioun vun der Zuel vun de mitochondrialen Biogenese-Genen, déi mir no 24 Stonnen observéiert hunn, net d'Méiglechkeet aus, datt d'Erhéijung vun der Zuel vun de Mitochondrien mat der Aktivatioun vun der Biogenese zu fréiere Zäitpunkten assoziéiert ass. Fréier Studien hunn gewisen, datt PPA d'PGC-1α mRNA a Protein an SH-SY5Y Zellen no 4 Stonnen 30 Minutten signifikant eropreguléiert, während Propionsäure d'mitochondrial Biogenese a Kallefhepatozyten iwwer PGC-1α no 12 Stonnen 39 Minutten verbessert. Interessanterweis ass PGC-1α net nëmmen en direkten Transkriptiounsregulator vun NRF1 an TFAM, mä et gouf och gewisen, datt et d'Aktivitéit vun MFN2 an DRP1 reguléiert andeems et d'Fissioun an d'Fusioun reguléiert47. Zesummegeholl ënnersträicht dëst déi enk Kopplung vu Mechanismen, déi mitochondrial kompensatoresch Reaktiounen reguléieren, déi duerch PPA induzéiert ginn. Ausserdeem reflektéieren eis Donnéeën eng bedeitend Dysreguléierung vun der Transkriptiounsreguléierung vun der Biogenese a vum Metabolismus ënner PPA-Stress.
D'Genen STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 an DRP1 gehéieren zu den zentralen Reguléierer vun der mitochondrialer Spaltung, Fusioun an Dynamik37,48,49. Et gi vill aner Genen, déi an der mitochondrialer Dynamik involvéiert sinn, awer STOML2, OPA1 an MFN2 goufen virdru schonn als differenziell methyléiert an ASD-Kohorten festgestallt,16 a verschidde onofhängeg Studien hunn Ännerungen an dësen Transkriptiounsfaktoren als Äntwert op mitochondriale Stress gemellt50,51.52. D'Expressioun vu souwuel OPA1 wéi och STOML2 gouf duerch 3 mM an 5 mM PPA-Behandlung signifikant reduzéiert (Fig. 3e, f). OPA1 ass ee vun de klassesche Reguléierer vun der mitochondrialer Fusioun duerch direkt Interaktioun mat MFN1 an 2 a spillt eng Roll beim Cristae-Remodeling an der mitochondrialer Morphologie53. Déi genee Roll vu STOML2 an der mitochondrialer Dynamik bleift onkloer, awer et gëtt Beweiser datt et eng Roll bei der mitochondrialer Fusioun, Biogenese a Mitophagie spillt.
STOML2 ass un der Erhalen vun der mitochondrialer Atmungskopplung an der Bildung vun Atmungskettekomplexer bedeelegt54,55 a gouf gewisen, datt et d'metabolesch Charakteristike vu Kriibszellen déifgräifend verännert56. Studien hunn gewisen, datt STOML2 de mitochondrialer Membranpotenzial an d'Biogenese duerch Interaktioun mat BAN a Cardiolipin fördert55, 57, 58. Zousätzlech hunn onofhängeg Studien gewisen, datt d'Interaktioun tëscht STOML2 a PINK1 d'Mitophagie reguléiert59,60. Besonnesch ass et ze bemierken, datt STOML2 direkt mat MFN2 interagéiert a stabiliséiert a spillt och eng wichteg Roll bei der Stabiliséierung vu laangen OPA1-Isoformen andeems et d'Protease hemmt, déi fir den OPA1-Degradatioun verantwortlech ass53,61,62. D'Reduktioun vun der STOML2-Expressioun, déi a PPA-Reaktiounen observéiert gëtt, kéint dës Fusiounsproteine ​​méi ufälleg fir den Degradatioun duerch Ubiquitin- a Proteasom-ofhängeg Weeër48 maachen. Obwuel déi genee Roll vu STOML2 an OPA1 an der dynamescher Äntwert op PPA net kloer ass, kann eng reduzéiert Expressioun vun dëse Fusiounsgenen (Figur 3) d'Gläichgewiicht tëscht Spaltung a Fusioun stéieren an zu enger reduzéierter Mitochondriengréisst féieren (Figur 3).1).
Op der anerer Säit ass d'OPA1-Proteinexpressioun no 24 Stonnen onverännert bliwwen, während d'mRNA- an d'Proteinniveauen vun MFN1, MFN2 oder DRP1 sech no der PPA-Behandlung net wesentlech geännert hunn (Fig. 3g-i, Fig. 4). Dëst kéint drop hiweisen, datt et keng Ännerungen an der Reguléierung vun dëse Faktoren gëtt, déi an der mitochondrialer Fusioun a Spaltung involvéiert sinn. Et ass awer derwäert ze bemierken, datt all dës véier Genen och duerch posttranskriptionell Modifikatiounen (PTMs) reguléiert ginn, déi d'Proteinaktivitéit kontrolléieren. OPA1 huet aacht alternativ Spleissvarianten, déi proteolytesch an de Mitochondrien gespalt ginn, fir zwou verschidden Isoformen ze produzéieren 63. D'Gläichgewiicht tëscht laangen a kuerzen Isoformen bestëmmt letztendlech d'Roll vun OPA1 bei der mitochondrialer Fusioun an der Erhaalung vum mitochondrialen Netzwierk 64. D'DRP1-Aktivitéit gëtt duerch Kalzium/Calmodulin-ofhängeg Proteinkinase II (CaMKII) Phosphoryléierung reguléiert, während den DRP1-Degradatioun duerch Ubiquitinatioun a SUMOyléierung reguléiert gëtt 65. Schlussendlech sinn souwuel DRP1 wéi och MFN1/2 GTPasen, sou datt d'Aktivitéit vun der GTP-Produktiounsquote an de Mitochondrien beaflosst ka ginn 66. Dofir, obwuel d'Expressioun vun dëse Proteinen konstant bleift, reflektéiert dëst net onbedéngt eng onverännert Proteinaktivitéit oder Lokalisatioun 67,68. Tatsächlech déngen existent PTM-Proteinrepertoire dacks als éischt Verteidegungslinn, déi fir d'Mediatioun vun akuten Stressreaktiounen verantwortlech ass. Wann et an eisem Modell e mëttelméissege metabolesche Stress gëtt, ass et wahrscheinlech, datt PTM eng erhéicht Aktivitéit vu Fusiouns- a Spaltungsproteine ​​fördert, fir d'Mitochondrienintegritéit genuch ze restauréieren, ouni datt eng zousätzlech Aktivéierung vun dëse Genen op mRNA- oder Proteinniveau néideg ass.
Zesummegeholl beliichten déi uewe genannten Donnéeën déi komplex an zäitofhängeg Reguléierung vun der mitochondrialer Morphologie an d'Erausfuerderungen, dës Mechanismen opzeklären. Fir d'Genexpression ze studéieren, ass et als éischt néideg, spezifesch Zilgenen am Signalwee z'identifizéieren. Eis Donnéeën weisen awer, datt Genen am selwechte Signalwee net op déiselwecht Aart a Weis op dee selwechte Stress reagéieren. Tatsächlech hunn fréier Studien gewisen, datt verschidde Genen am selwechte Signalwee verschidde zäitlech Äntwertprofiler opweise kënnen30,46. Zousätzlech gëtt et komplex posttranskriptionell Mechanismen, déi d'Bezéiung tëscht Transkriptioun a Genfunktioun stéieren. Proteomikstudien kënnen Abléck an den Impakt vu PTMs a Proteinfunktioun ginn, awer si stellen och Erausfuerderungen, dorënner Methoden mat nidderegem Duerchsatz, héich Signal-Rausch-Verhältnisser a schlecht Opléisung.
An dësem Kontext huet d'Studie vun der mitochondrialer Morphologie mat Hëllef vun TEM an MEL e grousst Potenzial fir fundamental Froen iwwer d'Bezéiung tëscht der mitochondrialer Dynamik a Funktioun an dem Afloss vun dëser Krankheet ze beäntwerten. Am wichtegsten ass, datt TEM eng direkt Method fir d'Miessung vun der mitochondrialer Morphologie als konvergenten Endpunkt vun der mitochondrialer Dysfunktioun an Dynamik ubitt51. MEL bitt och eng direkt Method fir d'Visualiséierung vun Spaltungs- a Fusiounsereignisser an enger dräidimensionaler Zellëmfeld, wat d'Quantifizéierung vun der dynamescher mitochondrialer Remodeling erméiglecht, och wann et keng Ännerungen an der Genexpression gëtt33. Hei ënnersträichen mir d'Nëtzlechkeet vun de mitochondrialer Bildgebungstechniken bei sekundäre mitochondrialer Krankheeten. Dës Krankheeten si typescherweis duerch chronesche liichte metabolesche Stress charakteriséiert, deen duerch subtil Remodeling vu mitochondrialer Netzwierker anstatt akuten mitochondrialer Schued charakteriséiert ass. Wéi och ëmmer, déi mitochondrial Kompensatioun, déi néideg ass fir d'Mitose ënner chroneschem Stress z'erhalen, huet déifgräifend funktionell Konsequenzen. Am Kontext vun der Neurowëssenschaft kann e besser Verständnis vun dëse Kompensatiounsmechanismen wichteg Informatiounen iwwer déi pleiotrop Neuropathologie liwweren, déi mat der mitochondrialer Dysfunktioun verbonne ass.
Schlussendlech ënnersträichen eis Donnéeën d'Nëtzlechkeet vun Imaging-Techniken fir d'funktionell Konsequenze vun de komplexen Interaktiounen tëscht Genexpression, Proteinmodifikatiounen a Proteinaktivitéit ze verstoen, déi d'neuronal Mitochondriendynamik kontrolléieren. Mir hunn PPA benotzt fir mitochondrial Dysfunktioun an engem neuronalen Zellmodell ze modelléieren, fir Abléck an d'mitochondrial Komponent vun ASD ze kréien. SH-SY5Y Zellen, déi mat PPA behandelt goufen, hunn Ännerungen an der mitochondrialer Morphologie gewisen: Mitochondrien goufe kleng a ronn, an d'Cristae ware schlecht definéiert, wa se mat TEM observéiert goufen. D'MEL-Analyse weist, datt dës Ännerungen gläichzäiteg mat enger Erhéijung vun de Spaltungs- a Fusiounsereignisser optrieden, fir dat mitochondrial Netzwierk als Äntwert op liichte metabolesche Stress z'erhalen. Ausserdeem stéiert PPA d'transkriptiounsreguléierung vum mitochondriale Metabolismus an der Homöostase signifikant. Mir hunn cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 an OPA1 als Schlësselmitochondrienregulatoren identifizéiert, déi duerch PPA-Stress ënnerbrach ginn a kéinten eng Roll bei der Vermittlung vu PPA-induzéierte Verännerungen an der mitochondrialer Morphologie a Funktioun spillen. Zukünfteg Studien sinn néideg fir PPA-induzéiert zäitlech Verännerungen an der Genexpression a Proteinaktivitéit, Lokalisatioun a posttranslationale Modifikatiounen besser ze charakteriséieren. Eis Donnéeën ënnersträichen d'Komplexitéit an d'interofhängegkeet vun de Reguléierungsmechanismen, déi d'mitochondrial Stressreaktioun vermëttelen, a demonstréieren d'Nëtzlechkeet vun TEM an aner Bildgebungstechniken fir méi gezielt mechanistesch Studien.
D'SH-SY5Y Zelllinn (ECACC, 94030304-1VL) gouf vu Sigma-Aldrich kaaft. SH-SY5Y Zellen goufen an Dulbecco's modifizéiertem Eagle's Medium/F-12 Nährstoffmëschung (DMEM/F-12) an L-Glutamin (SC09411, ScienCell) a 25 cm2 Kolben, ergänzt mat 20% fetaltem Rinderserum (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) an 1% Penicillin-Streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) bei 37 °C, 5% CO2, ugebaut. D'Zellen goufen bis zu 80% Konfluenz mat 0,05% Trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific) subkultivéiert, bei 300 g zentrifugéiert an mat enger Dicht vun ongeféier 7 × 105 Zellen/ml ausgeplatt. All Experimenter goufen op ondifferenzéierten SH-SY5Y Zellen tëscht de Passagen 19–22 duerchgefouert. PPA gëtt als NaP verabreicht. Léist NaP-Pulver (CAS Nr. 137-40-6, chemesch Formel C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) a waarmem MilliQ-Waasser op eng Konzentratioun vun 1 M op a späichert bei 4 °C. Verdënnt dës Léisung um Dag vun der Behandlung mat 1 M PPA op 3 mM a 5 mM PPA a serumfräie Medium (DMEM/F-12 mat L-Glutamin). D'Behandlungskonzentratioune fir all Experimenter waren kee PPA (0 mM, Kontroll), 3 mM a 5 mM PPA. D'Experimenter goufen an op d'mannst dräi biologesche Widderspréch duerchgefouert.
SH-SY5Y-Zellen goufen a Kolben vun 25 cm³ mat enger Rate vun 5,5 × 105 Zellen/ml ausgesaat a fir 24 Stonnen ugebaut. D'PPA-Behandlung gouf virun 24 Stonnen Inkubatioun an de Kolben bäigefüügt. Sammelt Zellpellets no normale Subkulturprotokoller fir Säugetiergewebe (ugefaasst beschriwwen). Resuspendéiert d'Zellpellet an 100 µl 2,5% Glutaraldehyd, 1× PBS a späichert se bei 4 °C bis zur Veraarbechtung. SH-SY5Y-Zellen goufen kuerz zentrifugéiert fir d'Zellen ze pelletéieren an 2,5% Glutaraldehyd, 1× PBS-Léisung ze entfernen. Resuspendéiert de Sediment an engem 4% Agarosegel, deen an destilléiertem Waasser preparéiert gouf (de Verhältnes vun Agarose zum Sedimentvolumen ass 1:1). Agarose-Stécker goufen op Gitter op flaach Placken geluecht a mat 1-Hexadecen beschichtet, ier se ënner Héichdrock afréiert goufen. D'Prouwen goufen 24 Stonnen an 100% dréchenem Aceton bei -90 °C agefruer. D'Temperatur gouf duerno op -80 °C erhéicht an eng Léisung vun 1% Osmiumtetroxid an 0,1% Glutaraldehyd gouf dobäigesat. D'Prouwen goufen 24 Stonnen bei -80 °C gelagert. Duerno gouf d'Temperatur iwwer e puer Deeg graduell op Raumtemperatur erhéicht: vun -80 °C bis -50 °C fir 24 Stonnen, op -30 °C fir 24 Stonnen, op -10 °C fir 24 Stonnen a schliisslech op Raumtemperatur.
No der kryogener Virbereedung goufen d'Prouwe mat Harz imprägnéiert an ultradënn Schnëtter (∼100 nm) goufe mat engem Leica Reichert UltracutS Ultramikrotom (Leica Microsystems) gemaach. D'Schnëtter goufe mat 2% Uranylacetat a Bleicitrat gefierft. D'Prouwe goufe mat engem FEI Tecnai 20 Transmissiounselektronemikroskop (ThermoFisher (fréier FEI), Eindhoven, Holland) mat 200 kV (Lab6 Transmitter) an enger Gatan CCD Kamera (Gatan, UK) mat engem Tridiem Energiefilter observéiert.
An all technescher Replikat goufen op d'mannst 24 Eenzelzellbiller opgeholl, fir insgesamt 266 Biller. All Biller goufen mat dem Region of Interest (ROI) Makro an dem Mitochondria Makro analyséiert. De Mitochondriale Makro baséiert op publizéierte Methoden17,31,32 an erlaabt eng semi-automatiséiert Batchveraarbechtung vun TEM-Biller a Fiji/ImageJ69. Kuerz gesot: d'Bild gëtt invertéiert an ëmgedréint mat Hëllef vun der Rolling Ball Hannergrondsubtraktioun (60 Pixel Radius) an engem FFT Bandpassfilter (mat 60 respektiv 8 Pixel ieweschten an ënneschten Grenzen) an enger vertikaler Linnënnerdréckung mat enger Orientéierungstoleranz vu 5%. Dat veraarbecht Bild gëtt automatesch mat engem Maximum Entropie Algorithmus geschwankt an eng binär Mask gëtt generéiert. Bildregiounen, déi mat manuell ausgewielten ROIs an de réie TEM-Biller assoziéiert sinn, goufen extrahéiert, wouduerch d'Mitochondrien charakteriséiert goufen an d'Plasmamembran an aner Regiounen mat héijem Kontrast ausgeschloss goufen. Fir all extrahéiert ROI goufen binär Partikelen, déi méi grouss wéi 600 Pixel waren, analyséiert, an d'Partikelfläch, de Perimeter, d'Haapt- an d'Nieweachs, den Feret-Duerchmiesser, d'Ronnheet an d'Kreeslafkaräte goufen mat den agebaute Miessfunktioune vu Fiji/ImageJ gemooss. No Merrill, Flippo a Strack (2017) goufen d'Fläch 2, d'Partikelaspektverhältnis (Verhältnis vun der Haapt- zur Nieweachs) an de Formfaktor (FF) aus dësen Donnéeën berechent, wou FF = Perimeter 2/4pi x Fläch ass. D'Definitioun vun der parametrescher Formel kann a Merrill, Flippo a Strack (2017) fonnt ginn. Déi ernimmt Makroen sinn op GitHub verfügbar (kuckt d'Data Disponibilitéitserklärung). Am Duerchschnëtt goufen ongeféier 5.600 Partikelen pro PPA-Behandlung analyséiert, fir insgesamt ongeféier 17.000 Partikelen (Donnéeën net gewisen).
SH-SH5Y-Zellen goufen a Kulturschalen mat 8 Kammeren (ThermoFisher, #155411) placéiert, fir d'Adhäsioun iwwer Nuecht z'erméiglechen, an duerno mat TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) an Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) inkubéiert. Biller goufen mat 405 nm an 561 nm Laser iwwer eng 10-Minutte-Ëmfeld opgeholl, an d'Rohbiller goufen als z-Stapel mat 10 Bildmikroskopfotoen mat engem az-Schrëtt vun 0,2 μm tëscht de Bildrahmen op 12 hannereneenfolgenden Zäitpunkten opgeholl. Biller goufen mat enger Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 Super-Resolutiounsplattform (Carl Zeiss, Oberkochen, Däitschland) mat engem LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 Objektiv gesammelt. Biller goufen an ImageJ analyséiert mat Hëllef vun enger virdru beschriwwener Pipeline an dem ImageJ Plugin fir Fusiouns- a Spaltungsereignisser, duerchschnëttlech Zuel vu mitochondrialen Strukturen an duerchschnëttlecht mitochondrial Volumen pro Zell33 ze moossen. MEL Makroen sinn op GitHub verfügbar (kuckt Datenverfügbarkeetserklärung).
SH-SY5Y Zellen goufen a Placke mat sechs Lächer mat enger Dicht vun 0,3 × 106 Zellen/ml fir 24 Stonnen virun der Behandlung gewuess. D'RNA gouf mat dem Quick-RNA™ Miniprep Protokoll (ZR R1055, Zymo Research) mat liichte Modifikatiounen extrahéiert: 300 μl RNA Lysepuffer ginn an all Lächer virum Aushuele bäigefüügt a all Prouf als leschte Schrëtt mat 30 μl DNase/RNase-fräiem Waasser lyséiert. All Prouwe goufen op Quantitéit a Qualitéit mat engem NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spektrophotometer iwwerpréift. Gesamtprotein aus Zelllysate gouf mat 200 μl RIPA Lysepuffer gewonnen, an d'Proteinkonzentratioun gouf mat dem Bradford Protein Assay quantifizéiert.
D'cDNA-Synthese gouf mat dem Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) no den Instruktioune vum Hiersteller mat e puer Modifikatiounen duerchgefouert. D'cDNA gouf a 20-μl Reaktiounen mat 0,7 bis 1 μg Gesamt-RNA synthetiséiert. Primer goufen aus virdru publizéierten Artikelen 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabell S1) ausgewielt an déi begleedend Sonden goufen mat dem PrimerQuest-Tool vun Integrated DNA Technologies entwéckelt. All Genen vun Interessi goufen op dat nukleart B2M-Gen normaliséiert. D'Genexpression vun STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC an OPA1 gouf mat RT-qPCR gemooss. De Mastermix huet LUNA Taq Polymerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM Forward- a Reverse-Primer, cDNA a Waasser vu PCR-Qualitéit abegraff, fir e Schlussvolumen vun 10 μL fir all Reaktioun ze kréien. D'Expressioun vun Divisiouns- a Spaltungsgenen (DRP1, MFN1/2) gouf mat TaqMan Multiplex-Assays gemooss. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) gouf no den Instruktioune vum Hiersteller mat klenge Modifikatioune benotzt. De Multiplex RT-qPCR Mastermix enthält 1X LUNA Taq Polymerase, 10 μM Forward- a Reverse-Primer, 10 μM Sond, cDNA a Waasser vu PCR-Qualitéit, wat zu engem Schlussvolumen vun 20 μL fir all Reaktioun gefouert huet. RT-qPCR gouf mat Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - Seriennummer: R0618110) duerchgefouert. D'Zyklusbedingungen sinn an der Tabell S1 gewisen. All cDNA-Prouwen goufen dräimol amplifizéiert an eng Standardkurv gouf mat enger Serie vun zéngfache Verdënnungen generéiert. Ausreißer an dräifache Prouwen mat enger Zyklusschwellstandardofwäichung (Ct) > 0,5 goufen aus der Analyse ewechgeholl fir d'Reproduzéierbarkeet vun den Daten ze garantéieren30,72. Déi relativ Genexpression gouf mat der 2-ΔΔCt79 Method berechent.
Proteinprouwen (60 μg) goufen mat Laemmli-Ladepuffer am Verhältnes 2:1 gemëscht a mat engem 12% faarflosen Proteingel (Bio-Rad #1610184) getest. D'Proteine ​​goufen op eng PVDF (Polyvinylidenfluorid)-Membran (#170-84156, Bio-Rad) mat dem Trans-Blot Turbo-System (#170-4155, Bio-Rad) transferéiert. D'Membran gouf blockéiert an 48 Stonnen laang mat de passenden primären Antikörper (OPA1, MFN1, MFN2 an DRP1) (verdënnt 1:1000) inkubéiert, gefollegt vun enger Stonn laanger Inkubatioun mat sekundären Antikörper (1:10.000). D'Membranen goufen dann mat Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) ofgebild an mat engem Bio-Rad ChemiDoc MP-System opgeholl. ImageLab Versioun 6.1 gouf fir d'Western-Blot-Analyse benotzt. Den urspréngleche Gel an de Blot sinn an der Figur S1 gewisen. Informatiounen iwwer Antikörper sinn an der Tabell S2 ze fannen.
D'Datensätz ginn als Mëttelwäert an de Standardfehler vum Mëttelwäert (SEM) vun op d'mannst dräi onofhängege Proufen duergestallt. D'Datensätz goufen op Normalitéit mam Shapiro-Wilks-Test getest (ausser et ass anescht uginn), ier eng Gauss-Verdeelung an gläich Standardofwäichungen ugeholl goufen an d'Analysen weidergefouert goufen. Zousätzlech gouf den Datensaz mat Fisher's MEL LSD (p < 0,05), One-Way ANOVA (Behandlung vs. Kontrollmëttelwäert) an Dunnett's Multiple Comparison Test analyséiert fir d'Signifikanz ze bestëmmen (p < 0,05). Signifikant p-Wäerter ginn am Grafik als *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 ugewisen. All statistesch Analysen a Grafike goufen mat GraphPad Prism 9.4.0 duerchgefouert a generéiert.
Fiji/ImageJ Makroen fir TEM-Bildanalyse sinn ëffentlech op GitHub verfügbar: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. De Mitochondrial Event Locator (MEL) Makro ass ëffentlech op GitHub verfügbar: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM a Vijaya A. Mitochondrien: Masterregulatoren vum Metabolismus, Homöostase, Stress, Alterung an Epigenetik. Indonesesch. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Villfälteg mitochondrial Dysfunktioun bei Schizophrenie, Komplex I als méiglecht pathologescht Zil. Schizophrenie. Resource. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. a Beal, MF Mitochondrial Dysfunktioun bei der Parkinson-Krankheet. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG a Mehta V. Gestresst Mitochondrien: Ziler vun der Invasioun bei der Alzheimer-Krankheet. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF a Ferreira GK Mitochondrien an d'Gehir: Bioenergetik a méi. Neurotoxine. resource. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Pleiotropesch Mitochondrien: den Impakt vun de Mitochondrien op d'Entwécklung vun Neuronen a Krankheeten. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. a Morais, VA Mitochondrial Biogenese an Neuronen: wéi a wou. Internationalitéit. J. Mohr. d'Wëssenschaft. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. a Zhao, J. Reguléierung vun der Mitochondriendynamik bei Säugetieren: Méiglechkeeten an Erausfuerderungen. front. endokrin. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. a Slack, RS Mitochondrial Dynamik an der Reguléierung vun der Neurogenese: vum entwéckelte bis zum erwuessene Gehir. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).