Den Artikel ass Deel vum Fuerschungsthema "Verbesserung vun der Resistenz vu Leguminosen géint Pathogenen a Schädlinge", kuckt all 5 Artikelen.
De Verursaacher vun der Pilznekrose vu Planzen, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, benotzt eng méistufeg Strategie fir verschidde Wirtsplanzen z'infizéieren. Dës Studie proposéiert d'Benotzung vum Diamin L-Ornithin, enger net-proteinescher Aminosäure, déi d'Synthese vun aneren essentiellen Aminosäuren stimuléiert, als alternativ Behandlungsstrategie fir déi molekular, physiologesch a biochemesch Reaktiounen vu Phaseolus vulgaris L. op wäisse Schimmel, verursaacht duerch Pseudomonas sclerotiorum, ze verbesseren. In-vitro-Experimenter hunn gewisen, datt L-Ornithin de Myzelwuesstum vu S. pyrenoidosa op eng dosisofhängeg Manéier signifikant hemmt. Ausserdeem kéint et d'Gravitéit vum wäisse Schimmel ënner Treibhausbedingungen signifikant reduzéieren. Ausserdeem huet L-Ornithin de Wuesstum vun de behandelte Planzen stimuléiert, wat drop hiweist, datt déi geteste Konzentratioune vun L-Ornithin net phytotoxesch fir déi behandelt Planzen waren. Zousätzlech huet L-Ornithin d'Expressioun vun net-enzymateschen Antioxidantien (total löslech Phenolen a Flavonoiden) an enzymateschen Antioxidantien (Katalase (CAT), Peroxidase (POX) a Polyphenoloxidase (PPO)) verbessert an d'Expressioun vun dräi antioxidant-verwandte Genen (PvCAT1, PvSOD a PvGR) erhéicht. Ausserdeem huet d'In-Silico-Analyse d'Präsenz vun engem mutmasslechen Oxaloacetat-Acetylhydrolase (SsOAH)-Protein am S. sclerotiorum-Genom opgedeckt, dat a punkto funktioneller Analyse, konservéiert Domänen an Topologie staark mat den Oxaloacetat-Acetylhydrolase (SsOAH)-Proteine ​​vun Aspergillus fijiensis (AfOAH) a Penicillium sp. (PlOAH) ähnlech war. Interessanterweis huet d'Zousätz vun L-Ornithin zum Kartoffeldextrosebouillon (PDB)-Medium d'Expressioun vum SsOAH-Gen a S. sclerotiorum-Myzelen däitlech reduzéiert. Ähnlech huet d'exogen Uwendung vun L-Ornithin d'Expressioun vum SsOAH-Gen a Pilzmyzelien, déi aus behandelte Planzen gesammelt goufen, däitlech reduzéiert. Schlussendlech huet d'Applikatioun vun L-Ornithin d'Oxalsäuresekretioun souwuel am PDB-Medium wéi och an infizéierte Blieder däitlech reduzéiert. Zesummefaassend spillt L-Ornithin eng Schlësselroll bei der Erhalen vum Redoxstatus an der Verbesserung vun der Ofwierreaktioun vun infizéierte Planzen. D'Resultater vun dëser Studie kéinten hëllefen, innovativ, ëmweltfrëndlech Methoden z'entwéckelen, fir wäisse Schimmel ze bekämpfen an säin Impakt op d'Bounenproduktioun an aner Kulturen ze reduzéieren.
Wäisse Schimmel, verursaacht duerch de nekrotrophe Pilz Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, ass eng zerstéierend, ertragsreduzéiert Krankheet, déi eng eescht Bedrohung fir d'global Bounenproduktioun (Phaseolus vulgaris L.) duerstellt (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum ass ee vun de schwéiersten Buedempilzpflanzepathogenen fir ze bekämpfen, mat engem breede Wirtsspektrum vu méi wéi 600 Planzenaarten an der Fäegkeet, Wirtsgewebe séier op eng net-spezifesch Manéier ze mazeréieren (Liang a Rollins, 2018). Ënner ongënschtege Konditioune mécht et eng kritesch Phas vu sengem Liewenszyklus duerch, wou et fir laang Zäit als schwaarz, haart, somähnlech Strukturen, genannt 'Sklerotie', am Buedem oder als wäiss, flauscheg Wuesstemer am Myzel oder Stammmark vun infizéierte Planzen dormant bleift (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum ass fäeg Sklerotie ze bilden, wat et erlaabt, op infizéierte Felder fir eng laang Zäit ze iwwerliewen an och während Krankheeten ze bestoe bleiwen (Schwartz et al., 2005). Sklerotie si räich u Nährstoffer, kënne laang Zäit am Buedem bestoe bleiwen a kënnen als primär Impfstoff fir spéider Infektiounen déngen (Schwartz et al., 2005). Ënner gënschtege Konditioune keimen d'Sklerotie a produzéiere Loftsporen, déi all iwwerierdesch Deeler vun der Planz infizéiere kënnen, dorënner Blummen, Stengelen oder Schoten (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum benotzt eng méistufeg Strategie fir seng Wirtsplanzen z'infizéieren, déi eng Serie vu koordinéierten Eventer vun der sklerotialer Keimung bis zur Symptomentwécklung involvéiert. Ufanks produzéiert S. sclerotiorum suspendéiert Sporen (genannt Ascosporen) aus pilzähnleche Strukturen, déi Apotheken genannt ginn, déi an d'Loft kommen an sech zu net-bewegleche Sklerotien op infizéierte Planzereschter entwéckelen (Bolton et al., 2006). De Pilz sekretéiert dann Oxalsäure, e Virulenzfaktor, fir de pH-Wäert vun der Planzenzellwand ze kontrolléieren, den enzymateschen Ofbau an d'Gewebeinvasioun ze förderen (Hegedus a Rimmer, 2005) an den oxidativen Ausbroch vun der Wirtsplanz z'ënnerdrécken. Dëse Versäureungsprozess schwächt d'Planzenzellwand a bitt e gënschtegt Ëmfeld fir den normale a effiziente Betrib vu Pilzzellwandofbauenden Enzymen (CWDEs), wouduerch de Pathogen déi kierperlech Barrière iwwerwanne kann an d'Wirtgewebe andrénge kann (Marciano et al., 1983). Wann et penetréiert ass, sekretéiert S. sclerotiorum eng Rei vu CWDEs, wéi Polygalacturonase a Cellulase, déi seng Verbreedung an infizéierte Gewëss erliichteren a Gewëssnekrose verursaachen. D'Progressioun vu Läsionen an Hyphenmatten féiert zu de charakteristesche Symptomer vu wäissem Schimmel (Hegedus a Rimmer, 2005). Mëttlerweil erkennen d'Wirtsplanzen Pathogen-assoziéiert molekular Mustere (PAMPs) iwwer Mustererkennungsrezeptoren (PRRs), wat eng Serie vu Signalereignisser ausléist, déi letztendlech d'Ofwierreaktiounen aktivéieren.
Trotz Joerzéngte vun Efforte fir d'Krankheetskontroll gëtt et bei Bounen, wéi och bei anere kommerzielle Kulturen, nach ëmmer e Mangel u genuch resistente Keimplasma, wéinst der Resistenz, dem Iwwerliewe an der Adaptabilitéit vum Pathogen. D'Krankheetsmanagement ass dofir extrem usprochsvoll a verlaangt eng integréiert, villfälteg Strategie, déi eng Kombinatioun vu Kulturpraktiken, biologescher Kontroll a chemesche Fungiziden enthält (O'Sullivan et al., 2021). D'chemesch Kontroll vu wäissem Schimmel ass am effektivsten, well Fungiziden, wa se richteg an zum richtegen Zäitpunkt ugewannt ginn, d'Verbreedung vun der Krankheet effektiv kontrolléiere kënnen, d'Gravitéit vun der Infektioun reduzéieren an d'Ertragsverloschter miniméieren. Wéi och ëmmer, Iwwerbenotzung an Iwwerverlässegkeet vu Fungiziden kënnen zu der Entstoe vu resistente Stämme vu S. sclerotiorum féieren an en negativen Impakt op Net-Zilorganismen, d'Buedemgesondheet an d'Waasserqualitéit hunn (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Dofir ass d'Sich no ëmweltfrëndleche Alternativen zu enger Top-Prioritéit ginn.
Polyamine (PA), wéi Putrescin, Spermidin, Spermin a Cadaverin, kënnen als villverspriechend Alternativen géint Buedem-gebonne Planzepathogenen déngen, wouduerch de Gebrauch vu geféierleche chemesche Fungiziden komplett oder deelweis reduzéiert gëtt (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). A méi héije Planze si PA a ville physiologesche Prozesser bedeelegt, dorënner, awer net limitéiert op, Zelldeelung, Differenzéierung a Reaktioun op abiotesch a biotesch Stressfaktoren (Killiny an Nehela, 2020). Si kënnen als Antioxidantien handelen, hëllefen, reaktiv Sauerstoffspezies (ROS) ze sammelen, d'Redox-Homöostase z'erhalen (Nehela a Killiny, 2023), ofwierbezunnen Genen induzéieren (Romero et al., 2018), verschidde Stoffwiesselweeër reguléieren (Nehela a Killiny, 2023), endogen Phytohormone moduléieren (Nehela a Killiny, 2019), systemesch erwuerwe Resistenz (SAR) etabléieren an d'Interaktioune tëscht Planzen a Pathogenen reguléieren (Nehela a Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Et ass derwäert ze bemierken, datt déi spezifesch Mechanismen a Rollen vu PA an der Planzeverteidegung jee no Planzenaart, Pathogenen an Ëmweltbedingungen variéieren. Déi am heefegsten PA a Planzen gëtt aus dem essentiellen Polyamin L-Ornithin biosynthetiséiert (Killiny a Nehela, 2020).
L-Ornithin spillt verschidde Rollen am Wuesstum a bei der Entwécklung vu Planzen. Zum Beispill hunn fréier Studien gewisen, datt Ornithin beim Räis (Oryza sativa) mat Stickstoffrecycling (Liu et al., 2018), Räisertrag, Qualitéit an Aroma (Lu et al., 2020) a Waasserstressreaktioun (Yang et al., 2000) a Verbindung bruecht ka ginn. Ausserdeem huet d'exogen Uwendung vun L-Ornithin d'Dréchttoleranz bei Zockerrüben (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) däitlech verbessert an de Salzstress bei Zwiebel- (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu a Çavuşoǧlu, 2021) a Cashew- (Anacardium occidentale) Planzen reduzéiert (da Rocha et al., 2012). Déi potenziell Roll vum L-Ornithin an der abiotescher Stressverteidegung kéint op seng Bedeelegung un der Prolin-Akkumulatioun a behandelte Planzen zréckzeféieren sinn. Zum Beispill gouf virdru bericht, datt Genen, déi mam Prolin-Metabolismus zesummenhänken, wéi d'Ornithin-Delta-Aminotransferase (Delta-OAT)- a Prolin-Dehydrogenase-Genen (ProDH1 a ProDH2), un der Ofwier vun Nicotiana benthamiana an Arabidopsis thaliana géint net-Host-Pseudomonas syringae-Stämme bedeelegt sinn (Senthil-Kumar a Mysore, 2012). Op der anerer Säit ass d'Ornithin-Decarboxylase (ODC) vu Pilze fir de Wuesstum vu Pathogenen noutwendeg (Singh et al., 2020). D'Zilsetzung vun ODC vu Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici iwwer Host-induzéiert Gen-Stëllung (HIGS) huet d'Resistenz vun Tomateplanzen géint Fusarium-Wëllkrankheet däitlech erhéicht (Singh et al., 2020). Déi potenziell Roll vun der exogener Ornithin-Applikatioun géint biotesch Stressfaktoren wéi Phytopathogenen ass awer net gutt ënnersicht ginn. Méi wichteg ass, datt d'Auswierkunge vum Ornithin op d'Krankheetsresistenz an déi domat verbonne biocheemesch a physiologesch Phänomener gréisstendeels onerfuerscht bleiwen.
D'Verständnis vun der Komplexitéit vun der S. sclerotiorum Infektioun vu Hülsenfrüchte ass wichteg fir d'Entwécklung vun effektive Kontrollstrategien. An dëser Studie wollten mir déi potenziell Roll vum Diamin L-Ornithin als Schlësselfaktor fir d'Verbesserung vun den Ofwiermechanismen an der Resistenz vu Hülsenfrüchteplanzen géint Sclerotinia sclerotiorum Infektioun identifizéieren. Mir stelle d'Hypothes op, datt L-Ornithin, zousätzlech zur Verbesserung vun den Ofwierreaktiounen vun infizéierte Planzen, och eng Schlësselroll fir d'Erhalen vum Redoxstatus spillt. Mir proposéieren, datt déi potenziell Auswierkunge vu L-Ornithin mat der Reguléierung vun enzymateschen an net-enzymateschen Antioxidantien-Ofwiermechanismen an der Interferenz mat Pilzpathogenitéits-/Virulenzfaktoren an assoziéierte Proteinen zesummenhänken. Dës duebel Funktionalitéit vu L-Ornithin mécht et zu engem villverspriechenden Kandidat fir eng nohalteg Strategie fir den Impakt vu wäissem Schimmel ze reduzéieren an d'Resistenz vu gewéinleche Hülsenfrüchteplanzen géint dëse potente Pilzpathogen ze verbesseren. D'Resultater vun der aktueller Studie kënnen bei der Entwécklung vun innovativen, ëmweltfrëndleche Methoden hëllefen, fir wäissem Schimmel ze kontrolléieren an säin Impakt op d'Hülsenfrüchteproduktioun ze reduzéieren.
An dëser Studie gouf eng empfindlech kommerziell Varietéit vun der gewéinlecher Boun, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), als experimentellt Material benotzt. Gesond Somen goufen frëndlecherweis vum Legume Research Department, Field Crops Research Institute (FCRI), Agricultural Research Center (ARC), Ägypten zur Verfügung gestallt. Fënnef Somen goufen a Plastikdëppen (bannenduerchmiesser 35 cm, Déift 50 cm) geséit, déi mat S. sclerotiorum-infizéierter Äerd ënner Treibhausbedingungen (25 ± 2 °C, relativ Fiichtegkeet 75 ± 1%, 8 Stonnen Liicht/16 Stonnen Däischtert) gefëllt waren. 7-10 Deeg nom Aussaat (DPS) goufen d'Séimlinger ausgedënnt, fir nëmmen nach zwee Séimlinger mat gläichméissegem Wuesstum an dräi voll ausgewuessene Blieder an all Dëppen ze hannerloossen. All Topfplanze goufen all zwou Wochen gewässert a monatlech mat der empfohlener Dosis fir déi jeeweileg Varietéit gedüngt.
Fir eng Konzentratioun vu 500 mg/L L-Ornithindiamin (och bekannt als (+)-(S)-2,5-Diaminopentansäure; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Däitschland) ze preparéieren, goufen 50 mg fir d'éischt an 100 ml sterilem destilléiertem Waasser opgeléist. D'Stammléisung gouf dann verdënnt a fir spéider Experimenter benotzt. Kuerz gesot, goufen sechs Serien vun L-Ornithin-Konzentratiounen (12,5, 25, 50, 75, 100 an 125 mg/L) in vitro getest. Zousätzlech gouf steril destilléiert Waasser als negativ Kontroll (Mock) an de kommerzielle Fungizid "Rizolex-T" 50% Benetzbarpulver (Toclofos-Methyl 20% + Thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gouvernement Gharbia, Ägypten) als positiv Kontroll benotzt. De kommerzielle Fungizid "Rizolex-T" gouf in vitro a fënnef Konzentratioune getest (2, 4, 6, 8 an 10 mg/L).
Prouwe vu Bouneschäng a Schoten, déi typesch Symptomer vu wäissem Schimmel weisen (Befallsquote: 10–30%), goufen op kommerzielle Bauerenhäff gesammelt. Obwuel déi meescht infizéiert Planzematerialien no Aart/Varietéit identifizéiert goufen (empfindlech kommerziell Varietéit Giza 3), waren aner, besonnesch déi, déi vu lokale Mäert kritt goufen, vun onbekannter Aart. Déi gesammelt infizéiert Materialien goufen als éischt Uewerflächen mat enger 0,5% Natriumhypochloritléisung fir 3 Minutten desinfizéiert, duerno e puermol mat sterilem destilléiertem Waasser gespullt a mat sterilem Filterpabeier dréchen ofgewëscht fir iwwerschësseg Waasser ze entfernen. Déi infizéiert Organer goufen dann aus dem mëttleren Tissu (tëscht gesondem an infizéiertem Tissu) a kleng Stécker geschnidden, op Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA)-Medium kultivéiert an bei 25 ± 2 °C mat engem 12 Stonne Liicht/12 Stonne Däischtert-Zyklus fir 5 Deeg inkubéiert fir d'Sklerotiebildung ze stimuléieren. D'Myzelspëtzmethod gouf och benotzt fir Pilzisolaten aus gemëschten oder kontaminéierte Kulturen ze purifizéieren. Dat gereinegt Pilzisolat gouf als éischt op Basis vu senge kulturelle morphologesche Charakteristiken identifizéiert an duerno op Basis vu mikroskopesche Charakteristiken als S. sclerotiorum bestätegt. Schlussendlech goufen all gereinegt Isolate op Pathogenitéit op der empfindlecher Bounenkultivar Giza 3 getest, fir de Koch-Postulate gerecht ze ginn.
Zousätzlech gouf dat invasivst S. sclerotiorum-Isolat (Isolat #3) weider bestätegt op Basis vun der interner transkribéierter Spacer (ITS)-Sequenzéierung, wéi vum White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017 beschriwwen. Kuerz gesot, goufen d'Isolate a Gromperendextrosebouillon (PDB) kultivéiert an 5-7 Deeg bei 25 ± 2 °C inkubéiert. De Pilzmyzel gouf dann gesammelt, duerch e Kéisduch gefiltert, zweemol mat sterilem Waasser gewäsch a mat sterilem Filterpabeier gedréchent. Genomesch DNA gouf mat dem Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit isoléiert (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). D'ITS rDNA Regioun gouf dann mat dem spezifesche Primerpaar ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; erwaart Gréisst: 540 bp) amplifizéiert (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Déi gereinegt PCR Produkter goufen zur Sequenzéierung agereecht (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). D'ITS rDNA Sequenzen goufen bidirektional mat der Sanger Sequenzéierungsmethod sequenzéiert. Déi zesummegesate Quersequenzen goufen dann mat den aktuellsten Donnéeën an der GenBank an dem National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) mat Hëllef vun der BLASTn Software verglach. D'Quersequenz gouf mat 20 anere S. sclerotiorum Stämm/Isolaten verglach, déi aus den aktuellsten Donnéeën an der NCBI GenBank (Supplementary Table S1) ofgeruff goufen, andeems ClustalW am Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; Versioun 11) benotzt goufen (Kumar et al., 2024). D'Evolutiounsanalyse gouf mat der Maximum-Likelihood-Method an dem allgemenge zäitreversiblen Nukleotid-Substitutiounsmodell duerchgefouert (Nei a Kumar, 2000). De Bam mat der héchster Log-Likelihood gëtt gewisen. Den initialen Bam fir d'heuristesch Sich gëtt ausgewielt andeems de Bam mat der héchster Log-Likelihood tëscht dem Neighbor-Joining (NJ) Bam (Kumar et al., 2024) an dem Maximum Parsimony (MP) Bam gewielt gëtt. Den NJ Bam gouf mat enger paarweiser Distanzmatrix konstruéiert, déi mam allgemenge zäitreversiblen Modell berechent gouf (Nei a Kumar, 2000).
Déi antibakteriell Aktivitéit vun L-Ornithin an dem Bakterizid "Rizolex-T" gouf in vitro mat der Agardiffusiounsmethod bestëmmt. Method: Huelt déi entspriechend Quantitéit vun der Stammléisung vun L-Ornithin (500 mg/L) a vermëscht se grëndlech mat 10 ml vum PDA-Nährstoffmedium fir Léisunge mat Endkonzentratioune vun 12,5, 25, 50, 75, 100 an 125 mg/L ze preparéieren. Fënnef Konzentratioune vum Fungizid "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 an 10 mg/L) a steril destilléiert Waasser goufen als Kontroll benotzt. Nodeems de Medium fest gouf, gouf e frësch preparéierte Myzelpropp vun der Sclerotinia sclerotiorum Kultur, 4 mm Duerchmiesser, an d'Mëtt vun der Petrischüssel transferéiert a bei 25±2°C kultivéiert bis de Myzel déi ganz Kontroll-Petrischüssel bedeckt huet, duerno gouf de Pilzwuesstum opgeholl. Berechent d'prozentuell Hemmung vum radiale Wuesstum vun S. sclerotiorum mat Hëllef vun der Equatioun 1:
D'Experiment gouf zweemol widderholl, mat sechs biologesche Widderhuelungen fir all Kontroll-/Experimentgrupp a fënnef Dëppen (zwou Planzen pro Dëppen) fir all biologescht Widderhuelung. All biologescht Widderhuelung gouf zweemol analyséiert (zwee technesch Widderhuelungen) fir d'Genauegkeet, d'Zouverlässegkeet an d'Reproduzéierbarkeet vun den experimentellen Resultater ze garantéieren. Zousätzlech gouf eng Probit-Regressiounsanalyse benotzt fir d'half-maximal Inhibitorkonzentratioun (IC50) an den IC99 ze berechnen (Prentice, 1976).
Fir de Potenzial vun L-Ornithin ënner Treibhausbedingungen ze evaluéieren, goufen zwou hannereneen Dëppenexperimenter duerchgefouert. Kuerz gesot, goufen Dëppen mat steriliséierter Lehm-Sandbuedem (3:1) gefëllt an mat enger frësch preparéierter Kultur vun S. sclerotiorum geimpft. Als éischt gouf dat invasivst Isolat vun S. sclerotiorum (Isolat #3) kultivéiert andeems ee Sklerot an der Halschent geschnidden, mat der Säit no ënnen op engem PDA geluecht an 4 Deeg bei 25°C an dauernder Däischtert (24 Stonnen) inkubéiert gouf fir de Myzelwuesstum ze stimuléieren. Duerno goufen véier Agar-Agar-Stëbs mat engem Duerchmiesser vu 5 mm vum viischten Rand geholl an mat 100 g vun enger steriler Mëschung aus Weess- a Räiskleie (1:1, v/v) geimpft an all Kolben goufen 5 Deeg bei 25 ± 2 °C ënner engem 12 Stonnen Liicht/12 Stonnen Däischtert-Zyklus inkubéiert fir d'Bildung vu Sklerotie ze stimuléieren. Den Inhalt vun alle Kolben gouf grëndlech gemëscht fir Homogenitéit ze garantéieren, ier d'Äerd bäigefüügt gouf. Dann goufen 100 g vun der koloniséierender Kleiemëschung an all Dëppen bäigefüügt, fir eng konstant Konzentratioun vu Pathogenen ze garantéieren. Déi geimpft Dëppen goufen gewässert, fir de Pilzwuesstum z'aktivéieren, a fir 7 Deeg an Treibhausbedingungen gestallt.
Fënnef Some vun der Giza 3 Varietéit goufen dann an all Dëppen geséit. Fir d'Dëppen, déi mat L-Ornithin an dem Fungizid Rizolex-T behandelt goufen, goufen déi steriliséiert Some fir d'éischt zwou Stonnen an enger wässerlecher Léisung vun den zwou Verbindungen mat enger finaler IC99 Konzentratioun vu ronn 250 mg/L respektiv 50 mg/L ageweit, an duerno eng Stonn virum Säen un der Loft gedréchent. Op der anerer Säit goufen d'Somen a sterilem destilléierte Waasser als negativ Kontroll ageweit. No 10 Deeg, virun der éischter Bewässerung, goufen d'Séimlinger ausgedënnt, sou datt nëmmen zwou propper Séimlinger an all Dëppen iwwreg bliwwe sinn. Zousätzlech, fir d'Infektioun mat S. sclerotiorum ze garantéieren, goufen d'Stämm vun der Bounenplanz am selwechten Entwécklungsstadium (10 Deeg) op zwou verschiddene Plazen mat engem steriliséierte Skalpell geschnidden an ongeféier 0,5 g vun der koloniséierender Kleiemëschung goufen an all Wonn geluecht, gefollegt vun héijer Fiichtegkeet fir d'Infektioun an d'Krankheetsentwécklung an alle geimpfte Planzen ze stimuléieren. Kontrollplanze goufen ähnlech verwonnt an eng gläich Quantitéit (0,5 g) vun enger steriler, onkoloniséierter Kleiemëschung gouf an d'Wonn geluecht an ënner héijer Fiichtegkeet gehale fir d'Ëmwelt fir d'Krankheetsentwécklung ze simuléieren an d'Konsistenz tëscht de Behandlungsgruppen ze garantéieren.
Behandlungsmethod: Bounekeimlinger goufen mat 500 ml vun enger wässerlecher Léisung vun L-Ornithin (250 mg/l) oder dem Fungizid Rizolex-T (50 mg/l) bewässert andeems de Buedem bewässert gouf, duerno gouf d'Behandlung dräimol mat engem Intervall vun 10 Deeg widderholl. Déi mat Placebo behandelt Kontrollen goufen mat 500 ml sterilem destilléierte Waasser bewässert. All Behandlungen goufen ënner Treibhausbedingungen duerchgefouert (25 ± 2°C, 75 ± 1% relativ Fiichtegkeet an eng Fotoperiod vun 8 Stonnen Liicht/16 Stonnen Däischtert). All Dëppen goufen all zwou Wochen bewässert a monatlech mat engem ausgeglachenen NPK-Dünger (20-20-20, mat 3,6% Schwefel an TE-Mikroelementer; Zain Seeds, Ägypten) an enger Konzentratioun vun 3-4 g/l duerch Blatsprëtzen no den Empfehlungen fir déi spezifesch Varietéit an den Instruktioune vum Hiersteller behandelt. Wann net anescht uginn, goufen voll ausgewuessent reif Blieder (2. an 3. Blieder vun uewen) aus all biologesche Replikat 72 Stonnen no der Behandlung (hpt) gesammelt, homogeniséiert, zesummegefaasst a bei -80 °C fir weider Analysen gelagert, dorënner, awer net limitéiert op, in situ histochemesch Lokalisatioun vun oxidativen Stressindikatoren, Lipidperoxidatioun, enzymatesch an net-enzymatesch Antioxidantien a Genexpression.
D'Intensitéit vun der wäisser Schimmelpilzinfektioun gouf all Woch 21 Deeg no der Impfung (dpi) mat enger Skala vun 1–9 (Ergänzungstabell S2) bewäert, baséiert op der Petzoldt- a Dickson-Skala (1996), déi vum Teran et al. (2006) modifizéiert gouf. Kuerz gesot, goufen d'Stämm a Branchen vu Bouneplanzen ugefaange vum Impfungspunkt ënnersicht, fir de Fortschrëtt vun de Läsionen laanscht d'Internoden an d'Kniet ze verfollegen. D'Distanz vun der Läsion vum Impfungspunkt bis zum wäitste Punkt laanscht de Stamm oder d'Abstéck gouf dann gemooss an e Score vun 1–9 gouf baséiert op der Lag vun der Läsion zougewisen, wou (1) keng sichtbar Infektioun beim Impfungspunkt ugedeit huet an (2–9) eng graduell Erhéijung vun der Läsionsgréisst an dem Fortschrëtt laanscht d'Kniet/Internoden ugedeit huet (Ergänzungstabell S2). D'Intensitéit vun der wäisser Schimmelpilzinfektioun gouf dann a Prozentsaz ëmgewandelt mat der Formel 2:
Zousätzlech gouf d'Fläch ënner der Krankheetsprogressiounskurve (AUDPC) mat der Formel (Shaner a Finney, 1977) berechent, déi viru kuerzem fir de wäisse Verrotten vun der normaler Boun (Chauhan et al., 2020) mat Hëllef vun der Equatioun 3 adaptéiert gouf:
Woubei Yi = Krankheetsschwéierkraaft zum Zäitpunkt ti, Yi+1 = Krankheetsschwéierkraaft zum nächste Zäitpunkt ti+1, ti = Zäitpunkt vun der éischter Miessung (an Deeg), ti+1 = Zäitpunkt vun der nächster Miessung (an Deeg), n = Gesamtzuel vun Zäitpunkten oder Observatiounspunkten. Wuestumsparameter vun de Bouneplanzen, dorënner d'Planzenhéicht (cm), d'Zuel vun de Branchen pro Planz an d'Zuel vun de Blieder pro Planz, goufen all Woch fir 21 Deeg an alle biologesche Widderspréch opgeholl.
An all biologescher Replikat goufen um 45. Dag no der Behandlung (15 Deeg no der leschter Behandlung) Blatproben (zweet an drëtt voll entwéckelt Blieder vun uewen) gesammelt. All biologesch Replikat bestoung aus fënnef Dëppen (zwou Planzen pro Dëppen). Ongeféier 500 mg vum zerquetschte Gewief goufe fir d'Extraktioun vu photosynthetesche Pigmenter (Chlorophyll a, Chlorophyll b a Carotinoiden) mat 80% Aceton bei 4 °C am Däischteren benotzt. No 24 Stonnen goufen d'Proben zentrifugéiert an den Iwwerstand gouf fir d'Bestimmung vum Chlorophyll a, Chlorophyll b a Carotinoidinhalt kolorimetresch mat engem UV-160A Spektrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) no der Method vum (Lichtenthaler, 1987) gesammelt, andeems d'Absorptioun bei dräi verschiddene Wellelängten (A470, A646 an A663 nm) gemooss gouf. Schlussendlech gouf den Inhalt vu photosynthetesche Pigmenter mat de folgende Formelen 4-6 berechent, déi vum Lichtenthaler (1987) beschriwwe goufen.
72 Stonnen no der Behandlung (hpt) goufen aus all biologesche Replikat Blieder (zweet an drëtt voll entwéckelt Blieder vun uewen) fir d'in situ histochemesch Lokalisatioun vu Waasserstoffperoxid (H2O2) a Superoxidanion (O2•−) gesammelt. All biologescht Replikat bestoung aus fënnef Dëppen (zwou Planzen pro Dëppen). All biologescht Replikat gouf am Duplikat analyséiert (zwee technesch Replikater) fir d'Genauegkeet, d'Zouverlässegkeet an d'Reproduzéierbarkeet vun der Method ze garantéieren. H2O2 an O2•− goufen mat 0,1% 3,3'-Diaminobenzidin (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Däitschland) respektiv Nitroblotetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Däitschland) bestëmmt, andeems d'Methode vum Romero-Puertas et al. (2004) an Adam et al. (1989) mat klenge Modifikatioune beschriwwe goufen. Fir d'histochemesch Lokalisatioun vun H2O2 in situ goufen d'Bliederblieder mat 0,1% DAB an 10 mM Tris-Puffer (pH 7,8) vakuuminfiltréiert an duerno bei Raumtemperatur 60 Minutte laang am Liicht inkubéiert. D'Bliederblieder goufen an 0,15% (v/v) TCA an 4:1 (v/v) Ethanol:Chloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Ägypten) gebleecht an duerno dem Liicht ausgesat, bis se däischter goufen. Ähnlech goufen d'Klappen mat 10 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,8) vakuuminfiltréiert, deen 0,1 w/v % HBT enthält, fir d'histochemesch Lokalisatioun vun O2•− in situ. D'Bliederblieder goufen 20 Minutte laang bei Raumtemperatur am Liicht inkubéiert, duerno wéi uewen gebleecht an dann beliicht, bis donkelblo/violett Flecken opgetruede sinn. D'Intensitéit vun der resultéierender bronger (als H2O2-Indikator) oder blo-violetter (als O2•−-Indikator) Faarf gouf mat der Fidschi-Versioun vum Bildveraarbechtungspaket ImageJ (http://fiji.sc; Zougrëff de 7. Mäerz 2024) bewäert.
Malondialdehyd (MDA; als Marker fir Lipidperoxidatioun) gouf no der Method vum Du a Bramlage (1992) mat liichte Modifikatioune bestëmmt. Blieder aus all biologesche Replikat (zweet an drëtt voll entwéckelt Blieder vun uewen) goufen 72 Stonnen no der Behandlung (hpt) gesammelt. All biologesch Replikat huet fënnef Dëppen abegraff (zwou Planzen pro Dëppen). All biologesch Replikat gouf am Duplikat analyséiert (zwee technesch Replikater) fir d'Genauegkeet, d'Zouverlässegkeet an d'Reproduzéierbarkeet vun der Method ze garantéieren. Kuerz gesot, goufen 0,5 g gemuelene Blatgewebe fir d'MDA-Extraktioun mat 20% Trichloressigsäure (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) mat 0,01% Butylhydroxytoluol (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) benotzt. Den MDA-Gehalt am Iwwerstand gouf dann kolorimetresch bestëmmt andeems d'Absorptioun bei 532 an 600 nm mat engem UV-160A Spektrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) gemooss gouf an duerno als nmol g−1 FW ausgedréckt.
Fir d'Bewäertung vun net-enzymateschen an enzymateschen Antioxidantien goufen aus all biologesche Replikat 72 Stonnen no der Behandlung (hpt) Blieder (zweet an drëtt voll entwéckelt Blieder vun uewen) gesammelt. All biologescht Replikat bestoung aus fënnef Dëppen (zwou Planzen pro Dëppen). All biologesch Prouf gouf am Duplikat analyséiert (zwou technesch Prouwe). Zwee Blieder goufen mat flëssegem Stéckstoff gemuel a direkt fir d'Bestimmung vun enzymateschen an net-enzymateschen Antioxidantien, Gesamtaminosäuren, Prolin-Gehalt, Genexpression an Oxalat-Quantifizéierung benotzt.
Déi total löslech Phenoler goufen mat dem Folin-Ciocalteu-Reagens (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) bestëmmt, mat liichte Modifikatioune vun der Method, déi vum Kahkonen et al. (1999) beschriwwe gouf. Kuerz gesot, ongeféier 0,1 g homogeniséiert Blatgewebe goufen 24 Stonnen laang mat 20 ml 80% Methanol am Däischteren extrahéiert an den Iwwerstand no der Zentrifugatioun gesammelt. 0,1 ml vum Proufextrakt gouf mat 0,5 ml Folin-Ciocalteu-Reagens (10%) gemëscht, 30 Sekonne laang gerëselt a 5 Minutten am Däischteren gelooss. Duerno goufen 0,5 ml vun enger 20% Natriumkarbonatléisung (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairo, Ägypten) an all Réier bäigefüügt, grëndlech gemëscht an 1 Stonn bei Raumtemperatur am Däischteren inkubéiert. No der Inkubatioun gouf d'Absorptioun vun der Reaktiounsmëschung bei 765 nm mat engem UV-160A-Spektrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) gemooss. D'Konzentratioun vun de gesamtléisleche Phenolen an de Proufextrakter gouf mat Hëllef vun enger Gallussäurekalibrierungskurve (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) bestëmmt an als Milligramm Gallussäureäquivalent pro Gramm frëschem Gewiicht (mg GAE g-1 frëschem Gewiicht) ausgedréckt.
Den totalen Inhalt u lösleche Flavonoiden gouf no der Method vum Djeridane et al. (2006) mat liichte Modifikatioune bestëmmt. Kuerz gesot, goufen 0,3 ml vum uewe genannten Methanolextrakt mat 0,3 ml vun enger 5% Aluminiumchloridléisung (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) gemëscht, kräfteg geréiert an duerno 5 Minutte bei Raumtemperatur inkubéiert, gefollegt vun der Zousetzung vun 0,3 ml vun enger 10% Kaliumacetatléisung (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Ägypten), grëndlech gemëscht an 30 Minutte bei Raumtemperatur am Däischteren inkubéiert. Nom Inkubatioun gouf d'Absorptioun vum Reaktiounsmëschung bei 430 nm mat engem UV-160A Spektrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) gemooss. D'Konzentratioun vun de gesamten lösleche Flavonoiden an de Proufextrakter gouf mat enger Rutin-Kalibratiounskurve (TCI America, Portland, OR, USA) bestëmmt an duerno als Milligramm Rutin-Äquivalent pro Gramm frëschem Gewiicht (mg RE g-1 frëschem Gewiicht) ausgedréckt.
Den gesamten Inhalt vu fräien Aminosäuren a Bouneblieder gouf mat engem modifizéierten Ninhydrinreagens (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) bestëmmt, baséiert op der Method, déi vum Yokoyama an Hiramatsu (2003) proposéiert a vum Sun et al. (2006) modifizéiert gouf. Kuerz gesot, goufen 0,1 g gemuelent Gewief mat engem pH-Puffer vun 5,4 extrahéiert, an 200 μL vum Iwwerstand gouf mat 200 μL Ninhydrin (2%) an 200 μL Pyridin (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA reagéiert, 30 Minutten an engem kachendem Waasserbad inkubéiert, duerno ofgekillt a bei 580 nm mat engem UV-160A Spektrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) gemooss. Op der anerer Säit gouf Prolin mat der Bates-Method bestëmmt (Bates et al., 1973). Prolin gouf mat 3% Sulfosalicylsäure (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) extrahéiert an no der Zentrifugatioun goufen 0,5 ml vum Iwwerstand mat 1 ml Äisesseg (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) an Ninhydrinreagens gemëscht, 45 Minutte bei 90°C inkubéiert, ofgekillt a bei 520 nm mat dem selwechte Spektrophotometer wéi uewen gemooss. Déi total fräi Aminosaieren a Prolin an de Blatextrakter goufen mat Hëllef vu Glycin- respektiv Prolin-Kalibratiounskurven (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) bestëmmt an als mg/g frësch Gewiicht ausgedréckt.
Fir d'enzymatesch Aktivitéit vun antioxidativen Enzymen ze bestëmmen, goufen ongeféier 500 mg homogeniséiert Gewief mat 3 ml 50 mM Tris-Puffer (pH 7,8) mat 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) an 7,5% Polyvinylpyrrolidon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) extrahéiert, 20 Minutte laang bei 10.000 × g ënner Killung (4 °C) zentrifugéiert, an den Iwwerstand (rouen Enzymextrakt) gouf gesammelt (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). D'Katalase (CAT) gouf duerno mat 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) an 100 μl vun enger 269 mM H2O2-Léisung reagéiert, fir hir enzymatesch Aktivitéit no der Method vum Aebi (1984) mat liichte Modifikatiounen ze bestëmmen (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). D'enzymatesch Aktivitéit vun der Guaiacol-ofhängeger Peroxidase (POX) gouf mat der Method vum Harrach et al. (2009) bestëmmt. (2008) mat klenge Modifikatiounen (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) an d'enzymatesch Aktivitéit vun der Polyphenoloxidase (PPO) gouf no der Reaktioun mat 2,2 ml vun 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), 100 μl Guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) an 100 μl vun 12 mM H2O2 bestëmmt. D'Method gouf liicht modifizéiert vun (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Den Assay gouf no der Reaktioun mat 3 ml Katecholléisung (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) duerchgefouert, déi frësch an 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0) preparéiert gouf. D'CAT-Aktivitéit gouf gemooss andeems d'Zersetzung vun H2O2 bei 240 nm (A240) iwwerwaacht gouf, d'POX-Aktivitéit gouf gemooss andeems d'Erhéijung vun der Absorbanz bei 436 nm (A436) iwwerwaacht gouf, an d'PPO-Aktivitéit gouf gemooss andeems d'Absorbanzschwankungen bei 495 nm (A495) all 30 Sekonnen fir 3 Minutte mat engem UV-160A Spektrophotometer (Shimadzu, Japan) opgeholl goufen.
Echtzäit-RT-PCR gouf benotzt fir d'Transkriptniveauen vun dräi antioxidant-verwandte Genen, dorënner Peroxisomal-Katalase (PvCAT1; GenBank Accessionsnummer KF033307.1), Superoxiddismutase (PvSOD; GenBank Accessionsnummer XM_068639556.1) a Glutathionreduktase (PvGR; GenBank Accessionsnummer KY195009.1), a Bouneblieder (dat zweet an drëtt voll entwéckelt Blieder vun uewen) 72 Stonnen no der leschter Behandlung ze detektéieren. Kuerz gesot, gouf d'RNA mat dem Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. Nr. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) no dem Protokoll vum Hiersteller isoléiert. Duerno gouf d'cDNA mat dem TOP script™ cDNA Synthesis Kit no den Instruktioune vum Hiersteller synthetiséiert. D'Primersequenze vun den uewe genannten dräi Genen sinn an der Ergänzungstabell S3 opgezielt. PvActin-3 (GenBank Accessiounsnummer: XM_068616709.1) gouf als Housekeeping-Gen benotzt an déi relativ Genexpression gouf mat der 2-ΔΔCT-Method berechent (Livak a Schmittgen, 2001). D'Aktin-Stabilitéit ënner biotesche Stress (inkompatibel Interaktioun tëscht übleche Hülsenfrüchte an dem Anthracnose-Pilz Colletotrichum lindemuthianum) an abiotesche Stress (Dréchent, Salzgehalt, niddreg Temperatur) gouf demonstréiert (Borges et al., 2012).
Mir hunn ufanks eng genomwäit In-Silico-Analyse vun Oxaloacetat-Acetylhydrolase (OAH)-Proteinen an S. sclerotiorum mat Hëllef vum Protein-Protein BLAST-Tool (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) duerchgefouert. Kuerz gesot, mir hunn OAH vun Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; Taxid: 1191702; GenBank-Accessiounsnummer XP_040799428.1; 342 Aminosäuren) a Penicillium lagena (PlOAH; Taxid: 94218; GenBank-Accessiounsnummer XP_056833920.1; 316 Aminosäuren) als Ufrosequenzen benotzt, fir dat homologt Protein an S. sclerotiorum (Taxid: 5180) ze kartéieren. BLASTp gouf géint déi kierzlech verfügbar S. sclerotiorum Genomdaten an der GenBank op der Websäit vum National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/, duerchgefouert.
Zousätzlech goufen dat virausgesot OAH-Gen aus S. sclerotiorum (SsOAH) an d'Evolutiounsanalyse an de phylogenetesche Bam vun AfOAH aus A. fijiensis CBS 313.89 a PlOAH aus P. lagena mat Hëllef vun der Maximum Likelihood Method a MEGA11 (Tamura et al., 2021) an dem JTT Matrix-baséierte Modell (Jones et al., 1992) ofgeleet. De phylogenetesche Bam gouf mat der Multiple Alignment Analyse vu Proteinsequenzen vun alle virausgesoten OAH-Genen (SsOAH) aus S. sclerotiorum an der Query Sequenz mat Hëllef vum Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos an Agarwala, 2007) kombinéiert. Zousätzlech goufen déi am beschten iwwereneestëmmend Aminosaiersequenze vun SsOAH aus S. sclerotiorum mat de Query-Sequenzen (AfOAH a PlOAH) (Larkin et al., 2007) mat Hëllef vu ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ausgeriicht, an erhale Regiounen an der Ausriichtung goufen mat dem ESPript-Tool visualiséiert (Versioun 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Ausserdeem goufen déi virausgesot funktionell representativ Domänen a konservéiert Plazen vum S. sclerotiorum SsOAH interaktiv a verschidde Familljen klasséiert mat Hëllef vum InterPro Tool (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Schlussendlech gouf eng dräidimensional (3D) Strukturmodelléierung vum virausgesoten S. sclerotiorum SsOAH mat Hëllef vum Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 Server Versioun 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) duerchgefouert a mat Hëllef vum SWISS-MODEL Server (https://swissmodel.expasy.org/) validéiert (Biasini et al., 2014). Déi virausgesot dräidimensional Strukturen (PDB-Format) goufen interaktiv mat dem UCSF-Chimera-Package (Versioun 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) visualiséiert (Pettersen et al., 2004).
Quantitativ Echtzäit-Fluoreszenz-PCR gouf benotzt fir den Transkriptiounsniveau vun Oxaloacetat-Acetylhydrolase (SsOAH; GenBank-Accessiounsnummer: XM_001590428.1) an de Myzelien vun der Sclerotinia sclerotiorum ze bestëmmen. Kuerz gesot, gouf S. sclerotiorum an e Kolben mat PDB geimpelt an an en Schüttelinkubator (Modell: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) bei 25 ± 2 °C fir 24 Stonnen bei 150 rpm an a stänneger Däischtert (24 Stonnen) placéiert fir de Myzelwuesstum ze stimuléieren. Duerno goufen d'Zellen mat L-Ornithin an dem Fungizid Rizolex-T bei endgültegen IC50-Konzentratiounen (ongeféier 40 respektiv 3,2 mg/L) behandelt an dann fir weider 24 Stonnen ënner de selwechte Konditiounen kultivéiert. No der Inkubatioun goufen d'Kulturen 5 Minutte laang bei 2500 rpm zentrifugéiert an den Iwwerstand (Pilzmyzel) gouf fir d'Genexpressionsanalyse gesammelt. Ähnlech gouf Pilzmyzel 0, 24, 48, 72, 96 an 120 Stonnen no der Infektioun vun infizéierte Planzen gesammelt, déi wäisse Schimmel a Wattemyzel op der Uewerfläch vun infizéierte Gewëss geformt haten. RNA gouf aus dem Pilzmyzel extrahéiert an duerno gouf cDNA wéi uewe beschriwwen synthetiséiert. D'Primersequenze fir SsOAH sinn an der Ergänzungstabell S3 opgezielt. SsActin (GenBank Accessiounsnummer: XM_001589919.1) gouf als Housekeeping-Gen benotzt, an déi relativ Genexpression gouf mat der 2-ΔΔCT Method berechent (Livak a Schmittgen, 2001).
Oxalsäure gouf a Gromperendextrosebouillon (PDB) a Planzeprouwen, déi de Pilzpathogen Sclerotinia sclerotiorum enthalen, no der Method vum Xu a Zhang (2000) mat liichte Modifikatioune bestëmmt. Kuerz gesot, goufen S. sclerotiorum Isolate a Kolben mat PDB geimpelt an duerno an engem Schüttelinkubator (Modell I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) bei 150 rpm bei 25 ± 2 °C fir 3-5 Deeg an dauernder Däischtert (24 Stonnen) kultivéiert, fir de Myzelwuesstum ze stimuléieren. Nom Inkubatioun gouf d'Pilzkultur fir d'éischt duerch Whatman #1 Filterpabeier gefiltert an duerno bei 2500 rpm fir 5 Minutten zentrifugéiert, fir Reschtmyzel ze entfernen. Den Iwwerstand gouf gesammelt a bei 4 °C fir eng weider quantitativ Bestëmmung vun Oxalat gelagert. Fir d'Virbereedung vu Planzeprouwen goufen ongeféier 0,1 g Planzegewebefragmenter dräimol mat destilléiertem Waasser (jeeweils 2 ml) extrahéiert. D'Prouwen goufen dann 5 Minutte laang bei 2500 rpm zentrifugéiert, den Iwwerstand gouf duerch Whatman Nr. 1 Filterpabeier dréche gefiltert a fir weider Analysen gesammelt.
Fir d'quantitativ Analyse vun Oxalsäure gouf d'Reaktiounsmëschung an engem Glasverschluss an der folgender Reiefolleg preparéiert: 0,2 ml Prouf (oder PDB-Kulturfiltrat oder Oxalsäure-Standardléisung), 0,11 ml Bromphenolblo (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml 1 M Schwefelsäure (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Ägypten) an 0,176 ml 100 mM Kaliumdichromat (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), an duerno gouf d'Léisung mat destilléiertem Waasser op 4,8 ml verdënnt, kräfteg vermëscht an direkt an e 60 °C Waasserbad gesat. No 10 Minutte gouf d'Reaktioun gestoppt andeems 0,5 ml Natriumhydroxidléisung (NaOH; 0,75 M) bäigefüügt goufen. D'Absorptioun (A600) vun der Reaktiounsmëschung gouf bei 600 nm mat engem UV-160 Spektrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) gemooss. PDB an destilléiert Waasser goufen als Kontrollen fir d'Quantifizéierung vu Kulturfiltraten respektiv Planzeprouwen benotzt. D'Oxalsäurekonzentratiounen an de Kulturfiltraten, ausgedréckt als Mikrogramm Oxalsäure pro Milliliter PDB-Medium (μg.mL−1), an an de Bliederextrakter, ausgedréckt als Mikrogramm Oxalsäure pro Gramm frësch Gewiicht (μg.g−1 FW), goufen mat enger Oxalsäurekalibratiounskurve bestëmmt (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Wärend der ganzer Studie goufen all Experimenter an engem komplett randomiséierten Design (CRD) mat sechs biologesche Widderhuelungen pro Behandlung a fënnef Dëppen pro biologesche Widderhuelung (zwou Planzen pro Dëppen) entworf, ausser et ass anescht uginn. Biologesch Widderhuelungen goufen am Duplikat analyséiert (zwee technesch Widderhuelungen). Technesch Widderhuelungen goufen benotzt fir d'Reproduzéierbarkeet vum selwechten Experiment ze kontrolléieren, awer net an der statistescher Analyse benotzt fir falsch Widderhuelungen ze vermeiden. D'Donnéeë goufen statistesch analyséiert mat Hëllef vun der Varianzanalyse (ANOVA), gefollegt vum Tukey-Kramer Honestly Significant Difference (HSD) Test (p ≤ 0,05). Fir In-vitro-Experimenter goufen d'IC50- an IC99-Wäerter mat dem Probit-Modell berechent an 95%-Konfidenzintervaller goufen berechent.
Insgesamt véier Isolate goufen aus verschiddene Sojabounenfelder am Gouvernement El Ghabiya an Ägypten gesammelt. Op PDA-Medium hunn all Isolate cremewäisst Myzel produzéiert, dat séier kottengwäiss gouf (Figur 1A) an dann am Sklerotiumstadium beige oder brong gouf. Sklerotie si meeschtens dicht, schwaarz, kugelfërmeg oder onregelméisseg a Form, 5,2 bis 7,7 mm laang an 3,4 bis 5,3 mm am Duerchmiesser (Figur 1B). Obwuel véier Isolate no 10-12 Deeg Inkubatioun bei 25 ± 2 °C e marginalt Muster vu Sklerotie um Rand vum Kulturmedium entwéckelt hunn (Fig. 1A), war d'Zuel vu Sklerotie pro Plack signifikant ënnerschiddlech tëscht hinnen (P < 0,001), woubäi Isolat 3 déi héchst Zuel vu Sklerotie hat (32,33 ± 1,53 Sklerotie pro Plack; Fig. 1C). Ähnlech huet den Isolat Nr. 3 méi Oxalsäure am PDB produzéiert wéi aner Isolate (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Abb. 1D). Den Isolat Nr. 3 huet typesch morphologesch a mikroskopesch Charakteristike vum phytopathogene Pilz Sclerotinia sclerotiorum gewisen. Zum Beispill, op PDA, sinn d'Kolonien vum Isolat Nr. 3 séier gewuess, ware cremewäiss (Figur 1A), ëmgedréint beige oder helllachsgielbrong, a si hunn 6-7 Deeg bei 25 ± 2°C gebraucht fir d'Uewerfläch vun enger Plack mat engem Duerchmiesser vun 9 cm komplett ze bedecken. Baséierend op den uewe genannten morphologeschen a mikroskopesche Charakteristiken gouf den Isolat Nr. 3 als Sclerotinia sclerotiorum identifizéiert.
Figur 1. Charakteristiken a Pathogenitéit vun S. sclerotiorum Isolaten aus übleche Leguminen. (A) Myzelwuesstum vu véier S. sclerotiorum Isolaten op PDA-Medium, (B) Sklerotie vu véier S. sclerotiorum Isolaten, (C) Zuel vu Sklerotie (pro Plack), (D) Oxalsäuresekretioun op PDB-Medium (μg.mL−1), an (E) Krankheetsschwéierkraaft (%) vu véier S. sclerotiorum Isolaten op der empfindlecher kommerzieller Leguminenkultivar Giza 3 ënner Treibhausbedingungen. Wäerter representéieren de Mëttelwäert ± SD vu fënnef biologesche Replikater (n = 5). Verschidde Buschtawen weisen statesch signifikant Ënnerscheeder tëscht de Behandlungen un (p < 0,05). (F–H) Typesch Wäiss Schimmelsymptomer sinn op ieweschte Stengelen a Siliquen, respektiv, 10 Deeg no der Impfung mam Isolat #3 (dpi) opgetrueden. (I) D'Evolutiounsanalyse vun der intern transkribéierter Spacer (ITS) Regioun vum S. sclerotiorum Isolat Nr. 3 gouf mat der Maximum-Likelihood-Method duerchgefouert a mat 20 Referenzisolate/Stämm verglach, déi aus der Datebank vum National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) kritt goufen. D'Zuelen iwwer de Clustering-Linnen weisen d'Regiounsofdeckung (%) un, an d'Zuelen ënner de Clustering-Linnen weisen d'Verzweigungslängt un.
Ausserdeem, fir d'Pathogenitéit ze bestätegen, goufen véier kritt S. sclerotiorum Isolate benotzt fir déi empfindlech kommerziell Bounenkultivar Giza 3 ënner Treibhausbedingungen ze inokuléieren, wat mat de Koch-Postulate konsequent ass (Fig. 1E). Obwuel all déi kritt Pilzisolate pathogen waren a konnten d'gréng Boun (cv. Giza 3) infizéieren, wouduerch typesch wäiss Schimmelsymptomer op allen iwwerierdesche Deeler (Fig. 1F), besonnesch op de Stämm (Fig. 1G) an de Schoten (Fig. 1H) 10 Deeg no der Inokulatioun (dpi) verursaacht goufen, war Isolat 3 dat aggressivst Isolat an zwou onofhängege Experimenter. Isolat 3 hat déi héchst Krankheetsschwéierkraaft (%) op Bounenplanzen (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 a 76,7 ± 3,1 7, 14 respektiv 21 Deeg no der Infektioun; Figur 1F).
D'Identifikatioun vum invasivsten S. sclerotiorum Isolat Nr. 3 gouf weider bestätegt op Basis vun der interner transkribéierter Spacer (ITS) Sequenzéierung (Fig. 1I). Eng phylogenetesch Analyse tëscht dem Isolat Nr. 3 an 20 Referenzisolate/stämm huet eng héich Ähnlechkeet (>99%) tëscht hinnen gewisen. Et ass derwäert ze bemierken, datt den S. sclerotiorum Isolat Nr. 3 (533 bp) eng héich Ähnlechkeet mam amerikaneschen S. sclerotiorum Isolat LPM36 huet, dat aus dréchenen Ierbsensomen isoléiert gouf (GenBank Accessiounsnummer MK896659.1; 540 bp), an dem chinesesche S. sclerotiorum Isolat YKY211 (GenBank Accessiounsnummer OR206374.1; 548 bp), wat Veilchen-Stammverfault (Matthiola incana) verursaacht, déi all separat uewen um Dendrogramm gruppéiert sinn (Figur 1I). Déi nei Sequenz gouf an der NCBI-Datebank deposéiert a krut den Numm "Sclerotinia sclerotiorum – Isolat YN-25" (GenBank-Accessiounsnummer PV202792). Et ass ze gesinn, datt Isolat 3 dat invasivst Isolat ass; dofir gouf dëst Isolat fir d'Studie an alle spéideren Experimenter ausgewielt.
Déi antibakteriell Aktivitéit vum Diamin L-Ornithin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Däitschland) a verschiddene Konzentratiounen (12,5, 25, 50, 75, 100 an 125 mg/L) géint S. sclerotiorum Isolat 3 gouf in vitro ënnersicht. Et ass bemierkenswäert, datt L-Ornithin en antibakteriellen Effekt ausgeübt huet an de radiale Wuesstum vun S. sclerotiorum Hyphäen op eng dosisofhängeg Manéier graduell gehemmt huet (Figur 2A, B). Bei der héchster getesteter Konzentratioun (125 mg/L) huet L-Ornithin déi héchst Myzelwuesstumshemmungsquote gewisen (99,62 ± 0,27%; Figur 2B), wat gläichwäerteg mam kommerzielle Fungizid Rizolex-T (Hemmungsquote 99,45 ± 0,39%; Figur 2C) bei der héchster getesteter Konzentratioun (10 mg/L) war, wat op eng ähnlech Effizienz hiweist.
Figur 2. In vitro antibakteriell Aktivitéit vun L-Ornithin géint Sclerotinia sclerotiorum. (A) Vergläich vun der antibakterieller Aktivitéit vu verschiddene Konzentratioune vun L-Ornithin géint S. sclerotiorum mam kommerzielle Fungizid Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Inhibitiounsquote (%) vum Myzelwuesstum vun S. sclerotiorum no der Behandlung mat verschiddene Konzentratioune vun L-Ornithin (12,5, 25, 50, 75, 100 an 125 mg/L) oder Rizolex-T (2, 4, 6, 8 an 10 mg/L). D'Wäerter representéieren de Mëttelwäert ± SD vu fënnef biologesche Replikater (n = 5). Verschidde Buschtawen bezeechnen statistesch Ënnerscheeder tëscht de Behandlungen (p < 0,05). (D, E) Probit-Modell-Regressiounsanalyse vun L-Ornithin a kommerziellem Fungizid Rizolex-T. D'Regressiounslinn vum Probit-Modell gëtt als eng duerchgezunn blo Linn duergestallt, an de Konfidenzintervall (95%) gëtt als eng gestrichelt rout Linn duergestallt.
Zousätzlech gouf eng Probit-Regressiounsanalyse duerchgefouert an déi entspriechend Diagrammer sinn an der Tabell 1 an de Figuren 2D,E gewisen. Kuerz gesot, den akzeptablen Steigungswäert (y = 2,92x − 4,67) an déi domat verbonne signifikant Statistiken (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 a p < 0,0001; Figur 2D) vum L-Ornithin hunn eng erhéicht antifungal Aktivitéit géint S. sclerotiorum am Verglach zum kommerziellen Fungizid Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 a p < 0,0001) ugedeit (Tabell 1).
Tabelle 1. Wäerter vun der hallwer maximaler Inhibitorkonzentratioun (IC50) an IC99 (mg/l) vun L-Ornithin a vum kommerzielle Fungizid "Rizolex-T" géint S. sclerotiorum.
Insgesamt huet L-Ornithin (250 mg/L) d'Entwécklung a Schwéierkraaft vu wäissem Schimmel op behandelte Bouneplanzen am Verglach mat onbehandelte Planzen, déi mat S. sclerotiorum infizéiert waren, däitlech reduzéiert (Kontroll; Figur 3A). Kuerz gesot, obwuel d'Krankheetsschwéierkraaft vun onbehandelte, infizéierte Kontrollplanzen no an no zougeholl huet (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 an 92,33 ± 3,06%), huet L-Ornithin d'Krankheetsschwéierkraaft (%) während dem ganze Experiment däitlech reduzéiert (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 an 26,36 ± 3,07) 7, 14 an 21 Deeg no der Behandlung (dpt) respektiv (Figur 3A). Ähnlech, wéi mat S. sclerotiorum infizéiert Bounenplanzen mat 250 mg/L L-Ornithin behandelt goufen, ass d'Fläch ënner der Krankheetsprogressiounskurve (AUDPC) vun 1274,33 ± 33,13 an der onbehandelter Kontroll op 281,03 ± 7,95 erofgaang, wat liicht méi niddreg war wéi déi vun der positiver Kontroll 50 mg/L Rizolex-T Fungizid (183,61 ± 7,71; Abb. 3B). Dee selwechten Trend gouf am zweeten Experiment observéiert.
Abb. 3. Effekt vun der exogener Uwendung vun L-Ornithin op d'Entwécklung vu wäissem Verrotten vun der normaler Boun, verursaacht duerch Sclerotinia sclerotiorum ënner Treibhausbedingungen. (A) Krankheetsprogressiounskurve vum wäisse Schimmel vun der normaler Boun no der Behandlung mat 250 mg/L L-Ornithin. (B) Fläch ënner der Krankheetsprogressiounskurve (AUDPC) vum wäisse Schimmel vun der normaler Boun no der Behandlung mat L-Ornithin. Wäerter representéieren de Mëttelwäert ± SD vu fënnef biologesche Widderspréch (n = 5). Verschidde Buschtawen bezeechnen statesch signifikant Ënnerscheeder tëscht de Behandlungen (p < 0,05).
Exogen Applikatioun vun 250 mg/L L-Ornithin huet d'Planzenhéicht (Fig. 4A), d'Zuel vun de Branchen pro Planz (Fig. 4B) an d'Zuel vun de Blieder pro Planz (Fig. 4C) no 42 Deeg graduell erhéicht. Wärend de kommerzielle Fungizid Rizolex-T (50 mg/L) den gréissten Effekt op all ënnersicht Ernärungsparameter hat, hat d'exogen Applikatioun vun 250 mg/L L-Ornithin den zweetgréissten Effekt am Verglach mat onbehandelte Kontrollen (Fig. 4A-C). Op der anerer Säit hat d'L-Ornithin-Behandlung keen signifikanten Effekt op den Inhalt vun de photosynthetesche Pigmenter Chlorophyll a (Fig. 4D) a Chlorophyll b (Fig. 4E), awer den Gesamtkarotinoidgehalt (0,56 ± 0,03 mg/g fr gew.) am Verglach mat der negativer Kontroll (0,44 ± 0,02 mg/g fr gew.) an der positiver Kontroll (0,46 ± 0,02 mg/g fr gew.; Fig. 4F) liicht erhéicht. Am Allgemengen weisen dës Resultater drop hin, datt L-Ornithin net phytotoxesch fir behandelt Hülsenfrüchte ass a souguer hire Wuesstum stimuléiere kann.
Abb. 4. Effekt vun der exogener L-Ornithin-Applikatioun op d'Wuestumseigenschaften a photosynthetesch Pigmenter vu Bounenblieder, déi mat Sclerotinia sclerotiorum ënner Treibhausbedingungen infizéiert sinn. (A) Planzhéicht (cm), (B) Zuel vun de Branchen pro Planz, (C) Zuel vun de Blieder pro Planz, (D) Chlorophyll a-Gehalt (mg g-1 fr gew.), (E) Chlorophyll b-Gehalt (mg g-1 fr gew.), (F) Gesamtkarotinoidgehalt (mg g-1 fr gew.). D'Wäerter sinn de Mëttelwäert ± Standarddeviatioun vu fënnef biologesche Widderspréch (n = 5). Verschidde Buschtawen weisen statesch signifikant Ënnerscheeder tëscht de Behandlungen un (p < 0,05).
In situ histochemesch Lokalisatioun vu reaktive Sauerstoffspezies (ROS; ausgedréckt als Waasserstoffperoxid [H2O2]) a fräie Radikale (ausgedréckt als Superoxidanionen [O2•−]) huet gewisen, datt d'exogen Uwendung vun L-Ornithin (250 mg/L) d'Akkumulatioun vun H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Abb. 5A) an O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Abb. 5B) am Verglach mat der Akkumulatioun vu souwuel onbehandelten infizéierte Planzen (173,31 ± 12,06 respektiv 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) wéi och vu Planzen, déi mat 50 mg/L vum kommerzielle Fungizid Rizolex-T (170,12 ± 9,50 respektiv 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt) no 72 Stonnen däitlech reduzéiert huet. Héich Konzentratioune vun H2O2 an O2•− hunn sech ënner hpt gesammelt (Fig. 5A, B). Ähnlech huet en TCA-baséierte Malondialdehyd (MDA)-Assay gewisen, datt mat S. sclerotiorum infizéiert Bounenplanzen méi héich Konzentratioune vun MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr gew.) an hire Blieder gesammelt hunn (Fig. 5C). Wéi och ëmmer, exogen Uwendung vun L-Ornithin huet d'Lipidperoxidatioun däitlech reduzéiert, wéi sech duerch d'Reduktioun vum MDA-Gehalt an de behandelte Planzen (33,08 ± 4,00 nmol.g fr gew.) beweist.
Abb. 5. Effekt vun der exogener L-Ornithin-Applikatioun op wichteg Markéierer vum oxidativen Stress an net-enzymatesch antioxidative Verteidegungsmechanismen a Bounenblieder, déi mat S. sclerotiorum 72 Stonnen no der Infektioun ënner Treibhausbedingungen infizéiert sinn. (A) Waasserstoffperoxid (H2O2; nmol g−1 FW) bei 72 hpt, (B) Superoxidanion (O2•−; nmol g−1 FW) bei 72 hpt, (C) Malondialdehyd (MDA; nmol g−1 FW) bei 72 hpt, (D) total löslech Phenoler (mg GAE g−1 FW) bei 72 hpt, (E) total löslech Flavonoiden (mg RE g−1 FW) bei 72 hpt, (F) total fräi Aminosaieren (mg g−1 FW) bei 72 hpt, an (G) Prolin-Gehalt (mg g−1 FW) bei 72 hpt. D'Wäerter representéieren de Mittelwert ± Standardofwäichung (Moyenne ± SD) vu 5 biologesche Replikater (n = 5). Verschidde Buschtawen weisen statesch signifikant Ënnerscheeder tëscht de Behandlungen un (p < 0,05).