Mir hunn virdru bericht, datt d'Serumniveauen vum Tryptophan-Metabolit, Indol-3-Propionsäure (IPA), bei Patienten mat Liewerfibrose méi niddreg sinn. An dëser Studie hu mir den Transkriptom an den DNA-Methylom an iwwergewiichtege Lieweren a Bezuch op d'Serum-IPA-Niveauen ënnersicht, souwéi d'Roll vun IPA bei der Induktioun vun der phenotypescher Inaktivéierung vun hepatischen Stellatzellen (HSCs) in vitro.
D'Studie huet 116 iwwergewiichteg Patienten ouni Typ-2-Diabetis mellitus (T2DM) (Alter 46,8 ± 9,3 Joer; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) abegraff, déi sech am Kuopio Bariatric Surgery Center (KOBS) enger bariatrescher Operatioun ënnerzunn hunn. D'Zirkulatiouns-IPA-Niveaue goufen duerch Flëssegkeetschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) gemooss, d'Lebertranskriptomanalyse gouf duerch total RNA-Sequenzéierung duerchgefouert, an d'DNA-Methylierungsanalyse gouf mat dem Infinium HumanMethylation450 BeadChip duerchgefouert. Mënschlech Liewerstellatzellen (LX-2) goufen fir In-vitro-Experimenter benotzt.
D'Serum-IPA-Niveaue korreléierten mat der Expressioun vu Genen, déi an apoptoteschen, mitophageschen a Longevity-Weeër an der Liewer involvéiert sinn. Den AKT-Serin/Threonin-Kinase 1 (AKT1)-Gen war dat heefegst an dominantst interagéierend Gen am Liewertranskript an den DNA-Methylierungsprofiler. D'IPA-Behandlung huet Apoptose induzéiert, d'mitochondrial Atmung reduzéiert an d'Zellmorphologie an d'mitochondrial Dynamik verännert andeems d'Expressioun vu Genen moduléiert gouf, déi bekannt sinn, fir Fibrose, Apoptose an d'Iwwerliewe vun LX-2-Zellen ze reguléieren.
Zesummegeholl ënnerstëtzen dës Donnéeën, datt IPA potenziell therapeutesch Effekter huet a kann Apoptose induzéieren an den HSC-Phänotyp a Richtung inaktiven Zoustand verréckelen, wouduerch d'Méiglechkeet vun der Hemmung vun der Liewerfibrose duerch Stéierung vun der HSC-Aktivatioun an dem mitochondriale Metabolismus erhéicht gëtt.
D'Prävalenz vun Iwwergewiicht a metaboleschem Syndrom gouf mat enger ëmmer méi grousser Inzidenz vu metabolisch assoziéierter Fettlebererkrankung (MASLD) a Verbindung bruecht; d'Krankheet betrëfft 25% bis 30% vun der Allgemengbevëlkerung [1]. Déi HaaptKonsequenz vun der MASLD-Etiologie ass Liewerfibrose, en dynamesche Prozess, deen duerch eng kontinuéierlech Akkumulation vun der fibröser extrazellulärer Matrix (ECM) charakteriséiert ass [2]. Déi Haaptzellen, déi un der Liewerfibrose bedeelegt sinn, sinn hepatesch Stellatzellen (HSCs), déi véier bekannt Phenotypen opweisen: roueg, aktivéiert, inaktivéiert a seneszent [3, 4]. HSCs kënnen aktivéiert ginn an vun enger roueger Form a proliferativ fibroblastähnlech Zellen mat héijem Energiebedarf transdifferenzéieren, mat enger erhéichter Expressioun vun α-Glattmuskelaktin (α-SMA) a Kollagen vum Typ I (Col-I) [5, 6]. Wärend der Ëmkéier vun der Liewerfibrose ginn aktivéiert HSCs iwwer Apoptose oder Inaktivéierung eliminéiert. Dës Prozesser ëmfaassen d'Downreguléierung vu fibrogenen Genen an d'Moduléierung vu Prosurvival-Genen (wéi NF-κB- a PI3K/Akt-Signalweeër) [7, 8], souwéi Ännerungen an der mitochondrialer Dynamik a Funktioun [9].
D'Serumniveauen vum Tryptophan-Metabolit Indol-3-Propionsäure (IPA), deen am Daarm produzéiert gëtt, goufen a mënschleche Stoffwiesselkrankheeten, dorënner MASLD, reduzéiert [10-13]. IPA ass mat der Zufuhr vu Ballaststoffer a Verbindung bruecht, ass bekannt fir seng antioxidativ an anti-inflammatoresch Effekter a schwächt de Phenotyp vun der duerch d'Ernährung induzéierter net-alkoholescher Steatohepatitis (NASH) in vivo an in vitro [11-14]. E puer Beweiser stamen aus eiser fréierer Studie, déi gewisen huet, datt d'Serumniveauen vun der IPA bei Patienten mat Liewerfibrose méi niddreg waren wéi bei iwwergewiichtege Patienten ouni Liewerfibrose an der Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Ausserdeem hu mir gewisen, datt d'IPA-Behandlung d'Expressioun vu Genen reduzéiere kann, déi klassesch Marker fir Zellhaftung, Zellmigratioun an hämatopoetescher Stammzellaktivatioun an engem mënschleche hepatesche Stellatzellmodell (LX-2) sinn, an e potenziellen hepatoprotektiven Metabolit ass [15]. Et bleift awer onkloer, wéi IPA d'Regressioun vun der Liewerfibrose induzéiert andeems et HSC-Apoptose a mitochondrial Bioenergetik aktivéiert.
Hei weisen mir datt Serum-IPA mat der Expressioun vu Genen assoziéiert ass, déi an Apoptose-, Mitophagie- a Longevity-Weeër an der Liewer vun iwwergewiichtege Leit ouni Typ-2-Diabetis (KOBS) beräichert sinn. Ausserdeem hu mir festgestallt, datt IPA d'Clearance an den Ofbau vun aktivéierten hämatopoetesche Stammzellen (HSCs) iwwer den Inaktivéierungswee induzéiere kann. Dës Resultater weisen eng nei Roll fir IPA op, wat et zu engem potenziellen therapeuteschen Zil mécht fir d'Regressioun vun der Liewerfibrose ze fërderen.
Eng fréier Studie an der KOBS-Kohort huet gewisen, datt Patienten mat Liewerfibrose méi niddreg zirkulierend IPA-Niveaue haten am Verglach mat Patienten ouni Liewerfibrose [15]. Fir de potenziellen Stéierungseffekt vum Typ-2-Diabetis auszeschléissen, hu mir 116 iwwergewiichteg Patienten ouni Typ-2-Diabetis (Duerchschnëttsalter ± SD: 46,8 ± 9,3 Joer; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tabell 1) aus der lafender KOBS-Studie als Studiepopulatioun rekrutéiert [16]. All Participanten hunn hir schrëftlech Zoustëmmung ginn an de Studienprotokoll gouf vum Ethikkomitee vum North Savo County Hospital am Aklang mat der Deklaratioun vun Helsinki (54/2005, 104/2008 an 27/2010) guttgeheescht.
Liewerbiopsie-Prouwen goufen während enger bariatrescher Operatioun geholl a vun erfuerene Pathologen histologesch no vir beschriwwene Critèren [17, 18] ënnersicht. D'Bewäertungskriterien sinn an der Ergänzungstabell S1 zesummegefaasst a goufen virdru scho beschriwwen [19].
Nüchternserumprouwen goufen duerch onzieleg Flëssegkeetschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) fir d'Metabolomikanalyse analyséiert (n = 116). D'Prouwen goufen mat engem UHPLC-qTOF-MS System (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Däitschland) analyséiert, wéi virdru beschriwwen19. D'Identifikatioun vum Isopropylalkohol (IPA) baséiert op der Retentiounszäit an dem Verglach vum MS/MS Spektrum mat puren Standarden. D'IPA Signalintensitéit (Peakfläch) gouf an alle weideren Analysen berücksichtegt [20].
D'Sequenzéierung vun der ganzer Liewer-RNA gouf mat Illumina HiSeq 2500 duerchgefouert an d'Donnéeë goufen wéi virdru beschriwwen virveraarbecht [19, 21, 22]. Mir hunn eng gezielt differentiell Expressiounsanalyse vun Transkripten duerchgefouert, déi d'Mitochondriefunktioun/Biogenese beaflossen, andeems mir 1957 Genen aus der MitoMiner 4.0 Datebank ausgewielt hunn [23]. D'Methylierungsanalyse vun der Liewer-DNA gouf mat dem Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) mat der selwechter Methodologie wéi virdru beschriwwen [24, 25] ausgeféiert.
Mënschlech Liewerstellatzellen (LX-2) goufe frëndlecherweis vum Prof. Stefano Romeo zur Verfügung gestallt a goufen an DMEM/F12-Medium (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) kultivéiert a gehale. Fir d'Aarbechtsdosis vun IPA ze wielen, goufen LX-2-Zellen 24 Stonnen mat verschiddene Konzentratioune vun IPA (10 μM, 100 μM an 1 mM; Sigma, 220027) an DMEM/F12-Medium behandelt. Fir d'Fäegkeet vun IPA z'ënnersichen, HSCs z'inaktivéieren, goufen LX-2-Zellen 24 Stonnen laang mat 5 ng/ml TGF-β1 (R&D Systems, 240-B-002/CF) an 1 mM IPA a serumfräie Medium behandelt. Fir déi entspriechend Kontrollmedikamenter gouf 4 nM HCL mat 0,1% BSA fir d'TGF-β1-Behandlung an 0,05% DMSO fir d'IPA-Behandlung benotzt, a béid goufen zesumme fir d'Kombinatiounsbehandlung benotzt.
D'Apoptose gouf mat dem FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit mat 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) no den Instruktioune vum Hiersteller bewäert. Kuerz gesot, LX-2 (1 × 105 Zellen/Lach) goufen iwwer Nuecht a 12-Lach-Platten kultivéiert an duerno mat verschiddene Dosen IPA oder IPA an TGF-β1 behandelt. Den Dag drop goufen déi schwiewend an adhärent Zellen gesammelt, trypsinéiert, mat PBS gewäsch, an Annexin V-Bindungspuffer resuspendéiert an 15 Minutte laang mat FITC-Annexin V an 7-AAD inkubéiert.
Mitochondrien a liewegen Zellen goufen op oxidativ Aktivitéit mat Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) gefierft. Fir MTR-Tester goufen LX-2-Zellen a gläicher Dicht mat IPA an TGF-β1 inkubéiert. No 24 Stonnen goufen déi lieweg Zellen trypsinéiert, mat PBS gewäsch an duerno mat 100 μM MTR a serumfräiem Medium bei 37 °C fir 20 Minutten inkubéiert, wéi virdru beschriwwen [26]. Fir d'Morphologie vun de liewegen Zellen goufen d'Zellgréisst an d'zytoplasmatesch Komplexitéit mat Hëllef vu Forward Scatter (FSC) respektiv Säitestreuungsparameter (SSC) analyséiert.
All Donnéeën (30.000 Evenementer) goufen mat NovoCyte Quanteon (Agilent) gesammelt an mat der NovoExpress® 1.4.1 oder der FlowJo V.10 Software analyséiert.
De Sauerstoffverbrauch (OCR) an d'extrazellulär Acidifikatiounsquote (ECAR) goufen a Echtzäit mat engem Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) gemooss, deen mat engem Seahorse XF Cell Mito Stress ausgestatt war, no den Instruktioune vum Hiersteller. Kuerz gesot, goufen 2 × 104 LX-2 Zellen/Lach op XF96 Zellkulturplacken ausgesaat. No der Inkubatioun iwwer Nuecht goufen d'Zellen mat Isopropanol (IPA) an TGF-β1 behandelt (Supplementary Methods 1). D'Datenanalyse gouf mat der Seahorse XF Wave Software duerchgefouert, déi de Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator enthält. Doraus gouf e Bioenergetic Health Index (BHI) berechent [27].
Total RNA gouf an cDNA transkribéiert. Fir spezifesch Methoden, kuckt Referenz [15]. Human 60S ribosomal acidic protein P0 (RPLP0) a Cyclophilin A1 (PPIA) mRNA Niveauen goufen als konstitutiv Genkontrollen benotzt. De QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, Holland) gouf mam TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) oder dem Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) benotzt, an déi relativ Genexpressionsfalt gouf mat Hëllef vu komparative Ct-Wäertzyklusparameteren (ΔΔCt) an der ∆∆Ct Method berechent. Detailer vun de Primeren sinn an den Ergänzungstabellen S2 an S3 ze fannen.
Nuklear DNA (ncDNA) a mitochondrial DNA (mtDNA) goufen mat dem DNeasy Blutt- a Gewësskit (Qiagen) extrahéiert, wéi virdru beschriwwen [28]. Déi relativ Quantitéit vun mtDNA gouf berechent andeems de Verhältnes vun all Zil-mtDNA-Regioun zum geometresche Mëttelwäert vun den dräi nuklearen DNA-Regiounen (mtDNA/ncDNA) berechent gouf, wéi an den Ergänzungsmethoden 2 detailléiert beschriwwen. Detailer vun de Primer fir mtDNA an ncDNA sinn an der Ergänzungstabell S4 ze fannen.
Lieweg Zellen goufen mat Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) gefierft, fir interzellulär an intrazellulär mitochondrial Netzwierker ze visualiséieren. LX-2 Zellen (1 × 104 Zellen/Well) goufen op Glasträger an entspriechende Kulturplacken mat Glasbuedem kultivéiert (Ibidi GmbH, Martinsried, Däitschland). No 24 Stonnen goufen lieweg LX-2 Zellen 20 Minutte laang mat 100 μM MTR bei 37 °C inkubéiert an d'Zellkäre goufen mat DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) gefierft, wéi virdru beschriwwen [29]. Mitochondrial Netzwierker goufen mat engem invertéierte Zeiss Axio Observer Mikroskop (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Däitschland) mat engem Zeiss LSM 800 Konfokalmodul bei 37 °C an enger befeuchteter Atmosphär mat 5% CO2 mat engem 63×NA 1.3 Objektiv visualiséiert. Mir hunn zéng Z-Serie Biller fir all Prouftyp opgeholl. All Z-Serie enthält 30 Sektiounen, all mat enger Déckt vun 9,86 μm. Fir all Prouf goufen Biller vun zéng verschiddene Siichtfelder mat der ZEN 2009 Software (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Däitschland) opgeholl, an eng mitochondrial Morphologieanalyse gouf mat der ImageJ Software (v1.54d) [30, 31] duerchgefouert, no de Parameteren, déi an den Ergänzungsmethoden 3 detailléiert sinn.
D'Zellen goufen mat 2% Glutaraldehyd an 0,1 M Phosphatpuffer fixéiert, gefollegt vun der Fixatioun mat 1% Osmiumtetroxid-Léisung (Sigma Aldrich, MO, USA), graduell mat Aceton dehydréiert (Merck, Darmstadt, Däitschland) a schliisslech an Epoxyharz agebett. Ultradënn Schnëtter goufen preparéiert a mat 1% Uranylacetat (Merck, Darmstadt, Däitschland) an 1% Bläicitrat (Merck, Darmstadt, Däitschland) gefierft. Ultrastrukturell Biller goufen mat engem JEM 2100F EXII Transmissiounselektronemikroskop (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) bei enger Beschleunigungsspannung vun 80 kV opgeholl.
D'Morphologie vun LX-2 Zellen, déi 24 Stonnen mat IPA behandelt goufen, gouf duerch Phasenkontrastmikroskopie bei 50-facher Vergréisserung mat engem Zeiss invertéierte Liichtmikroskop (Zeiss Axio Vert.A1 an AxioCam MRm, Jena, Däitschland) analyséiert.
Klinesch Donnéeë goufen als Moyenne ± Standardofwäichung oder Median (Interquartilberäich: IQR) ausgedréckt. Eng Een-Wee-Varianzanalyse (kontinuéierlech Variabelen) oder e χ²-Test (kategoresch Variabelen) goufen benotzt fir d'Ënnerscheeder tëscht den dräi Studiengruppen ze vergläichen. Déi falsch-positiv Rate (FDR) gouf benotzt fir Multiple Tester ze korrigéieren, a Genen mat FDR < 0,05 goufen als statesch signifikant ugesinn. D'Spearman-Korrelatiounsanalyse gouf benotzt fir d'CpG-DNA-Methylierung mat der IPA-Signalintensitéit ze korreléieren, mat nominellen p-Wäerter (p < 0,05).
D'Analyse vun de Liewerweeër gouf mat engem webbaséierten Tool fir d'Analyse vu Genen (WebGestalt) fir 268 Transkripten (nominal p < 0,01), 119 mat Mitochondrien assoziéiert Transkripten (nominal p < 0,05) a 4350 CpGen vun 3093 Liewertranskripten duerchgefouert, déi mat zirkulierenden IPA-Niveauen am Serum assoziéiert waren. Den gratis verfügbaren Venny DB (Versioun 2.1.0) Tool gouf benotzt fir iwwerlappend Genen ze fannen, a StringDB (Versioun 11.5) gouf benotzt fir Protein-Protein-Interaktiounen ze visualiséieren.
Fir den LX-2-Experiment goufen d'Prouwen op Normalitéit mam D'Agostino-Pearson-Test getest. D'Donnéeë goufe vun op d'mannst dräi biologesche Replikater gesammelt an enger One-Way-ANOVA mam Bonferroni Post-hoc-Test ënnerworf. E p-Wäert vu manner wéi 0,05 gouf als statistesch signifikant ugesinn. D'Donnéeë ginn als Moyenne ± SD presentéiert, an d'Zuel vun den Experimenter ass an all Figur uginn. All Analysen a Grafike goufen mat der statistescher Software GraphPad Prism 8 fir Windows (GraphPad Software Inc., Versioun 8.4.3, San Diego, USA) duerchgefouert.
Fir d'éischt hu mir den Zesummenhang vun den IPA-Niveaue vum Serum mat Transkripten aus der Liewer, dem Ganzkierper an dem Mitochondrien ënnersicht. Am gesamten Transkriptprofil war dat stäerkst Gen, dat mat den IPA-Niveaue vum Serum assoziéiert war, MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mitogen-aktivéiert Proteinkinase-aktivéiert Proteinkinase 3); am mitochondrienbezunnen Transkriptprofil war dat stäerkst assoziéiert Gen AKT1 (FDR = 0,7621; AKT Serin/Threonin-Kinase 1) (Zousätzlech Datei 1 an Zousätzlech Datei 2).
Mir hunn duerno global Transkripten (n = 268; p < 0,01) an mitochondrien-assoziéiert Transkripten (n = 119; p < 0,05) analyséiert, an hunn schlussendlech d'Apoptose als de bedeitendsten kanonesche Signalwee identifizéiert (p = 0,0089). Fir mitochondrialen Transkripten, déi mat Serum IPA-Niveauen assoziéiert sinn, hu mir eis op d'Apoptose (FDR = 0,00001), d'Mitophagie (FDR = 0,00029) an d'TNF-Signalweeër (FDR = 0,000006) konzentréiert (Figur 1A, Tabelle 2, an Ergänzungsfiguren 1A-B).
Iwwerlappend Analyse vu globalen, mitochondrien-assoziéierten Transkripten an DNA-Methylierung an der mënschlecher Liewer a Verbindung mat Serum-IPA-Niveauen. A representéiert 268 global Transkripten, 119 mitochondrien-assoziéiert Transkripten an DNA-methyléiert Transkripten, déi op 3092 CpG-Plazen ofgebild sinn, déi mat Serum-IPA-Niveauen assoziéiert sinn (p-Wäerter < 0,01 fir global Transkripten an DNA-methyléiert, a p-Wäerter < 0,05 fir mitochondrialen Transkripten). Déi wichtegst iwwerlappend Transkripten sinn an der Mëtt gewisen (AKT1 an YKT6). B D'Interaktiounskaart vun den 13 Genen mam héchsten Interaktiounsscore (0,900) mat anere Genen gouf aus de 56 iwwerlappende Genen (schwaarz Linnregioun) konstruéiert, déi signifikant mat Serum-IPA-Niveauen assoziéiert waren, mat Hëllef vum Online-Tool StringDB. Gréng: Genen, déi op d'Gene Ontology (GO) Zellkomponent ofgebild sinn: Mitochondrien (GO:0005739). AKT1 ass dat Protein mat dem héchste Score (0,900) fir Interaktioune mat anere Proteinen baséiert op den Donnéeën (baséiert op Text Mining, Experimenter, Datenbanken a Koexpressioun). Netzwierkknueten representéieren Proteinen, a Kanten representéieren Verbindungen tëscht Proteinen.
Well Metabolitte vun der Darmflora d'epigenetesch Zesummesetzung duerch DNA-Methylierung reguléiere kënnen [32], hu mir ënnersicht, ob d'IPA-Serumniveauen mat der DNA-Methylierung an der Liewer assoziéiert waren. Mir hunn festgestallt, datt déi zwou wichtegst Methylierungsplazen, déi mat den IPA-Serumniveauen assoziéiert sinn, no bei der prolin-serinräicher Regioun 3 (C19orf55) an dem Hëtzeschockproteinfamill B (klengt) Member 6 (HSPB6) waren (Zousätzlech Datei 3). D'DNA-Methylierung vu 4350 CpG (p < 0,01) war mat de IPA-Serumniveauen korreléiert a war u Longevity-Reguléierungsweeër beräichert (p = 0,006) (Figur 1A, Tabelle 2, an Ergänzungsfigur 1C).
Fir déi biologesch Mechanismen ze verstoen, déi den Associatiounen tëscht Serum-IPA-Niveauen, globalen Transkripten, Mitochondrien-assoziéierten Transkripten an DNA-Methylierung an der mënschlecher Liewer zugronn leien, hu mir eng Iwwerlappungsanalyse vun de Genen duerchgefouert, déi an der viregter Wee-Analyse identifizéiert goufen (Figur 1A). D'Resultater vun der Wee-Beräicherungsanalyse vun den 56 iwwerlappende Genen (bannent der schwaarzer Linn an der Figur 1A) hunn gewisen, datt de Apoptose-Wee (p = 0,00029) zwou Genen ervirgehuewen huet, déi an den dräi Analysen gemeinsam sinn: AKT1 an YKT6 (YKT6 v-SNARE Homolog), wéi am Venn-Diagramm gewisen (Ergänzungsfigur 2 a Figur 1A). Interessanterweis hu mir festgestallt, datt AKT1 (cg19831386) an YKT6 (cg24161647) positiv mat de Serum-IPA-Niveauen korreléiert waren (Zousätzlech Datei 3). Fir potenziell Proteininteraktiounen tëscht Genprodukter z'identifizéieren, hu mir 13 Genen mam héchste gemeinsame Regiounsscore (0,900) ënner 56 iwwerlappende Genen als Input ausgewielt an eng Interaktiounskaart konstruéiert. Geméiss dem Vertrauensniveau (marginalt Vertrauen) war den AKT1-Gen mam héchste Score (0,900) uewen (Figur 1B).
Baséierend op der Analyse vum Zellwee hu mir festgestallt, datt Apoptose de wichtegste Wee war, dofir hu mir ënnersicht, ob d'IPA-Behandlung d'Apoptose vun HSCs in vitro beaflosse géif. Mir hunn virdru gewisen, datt verschidden Dosen vun IPA (10 μM, 100 μM an 1 mM) net gëfteg fir LX-2 Zellen waren [15]. Dës Studie huet gewisen, datt d'IPA-Behandlung mat 10 μM an 100 μM d'Zuel vun de liewensfäegen an nekroteschen Zellen erhéicht huet. Am Verglach mat der Kontrollgrupp ass d'Zellviabilitéit awer bei enger Konzentratioun vun 1 mM IPA erofgaang, während d'Zellnekrosequote onverännert bliwwen ass (Figur 2A, B). Fir déi optimal Konzentratioun ze fannen, fir Apoptose an LX-2 Zellen ze induzéieren, hu mir 10 μM, 100 μM an 1 mM IPA fir 24 Stonnen getest (Figur 2A-E an Ergänzungsfigur 3A-B). Interessanterweis huet IPA 10 μM an 100 μM d'Apoptosequote (%) reduzéiert, awer IPA 1 mM huet d'spéit Apoptose an d'Apoptosequote (%) am Verglach mat der Kontroll erhéicht an dofir gouf se fir weider Experimenter gewielt (Figuren 2A-D).
IPA induzéiert Apoptose vun LX-2 Zellen. Annexin V an 7-AAD Duebelfärbungsmethod goufen benotzt fir d'Apoptotikrate an d'Zellmorphologie duerch Flusszytometrie ze quantifizéieren. BA Zellen goufen mat 10 μM, 100 μM an 1 mM IPA fir 24 Stonnen oder mat F–H TGF-β1 (5 ng/ml) an 1 mM IPA a serumfräiem Medium fir 24 Stonnen inkubéiert. A: lieweg Zellen (Annexin V -/ 7AAD-); B: nekrotesch Zellen (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: fréi (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: spéit (Annexin V+/7AAD.+); E, H: Prozentsaz vun de gesamte fréien an spéiden apoptoteschen Zellen an der Apoptotikrate (%). D'Donnéeë ginn als Moyenne ± SD ausgedréckt, n = 3 onofhängeg Experimenter. Statistesch Vergläicher goufen mat One-Way ANOVA mam Bonferroni Post hoc Test duerchgefouert. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Wéi mir virdru gewisen hunn, kann 5 ng/ml TGF-β1 d'HSC-Aktivatioun induzéieren andeems se d'Expressioun vu klassesche Markergenen erhéicht [15]. LX-2 Zellen goufen mat 5 ng/ml TGF-β1 an 1 mM IPA a Kombinatioun behandelt (Fig. 2E–H). D'TGF-β1 Behandlung huet d'Apoptosequote net geännert, awer d'IPA Kobehandlung huet d'spéit Apoptose an d'Apoptosequote (%) am Verglach mat der TGF-β1 Behandlung erhéicht (Fig. 2E–H). Dës Resultater weisen datt 1 mM IPA d'Apoptose an LX-2 Zellen onofhängeg vun der TGF-β1 Induktioun förderen kann.
Mir hunn den Effekt vun IPA op d'mitochondrial Atmung an LX-2 Zellen weider ënnersicht. D'Resultater hunn gewisen, datt 1 mM IPA d'Parameter vun der Sauerstoffverbrauchsquote (OCR) reduzéiert huet: net-mitochondrial Atmung, basal an maximal Atmung, Protonenleck an ATP-Produktioun am Verglach mat der Kontrollgrupp (Figur 3A, B), während de bioenergetesche Gesondheetsindex (BHI) sech net geännert huet.
IPA reduzéiert d'mitochondrial Atmung an LX-2 Zellen. D'mitochondrial Atmungskurv (OCR) gëtt als mitochondrial Atmungsparameter duergestallt (net-mitochondrial Atmung, basal Atmung, maximal Atmung, Protonenleck, ATP Generatioun, SRC an BHI). D'Zellen A an B goufen 24 Stonnen mat 10 μM, 100 μM an 1 mM IPA inkubéiert. D'Zellen C an D goufen 24 Stonnen mat TGF-β1 (5 ng/ml) an 1 mM IPA a serumfräiem Medium inkubéiert. All Miessunge goufen mam CyQuant Kit op den DNA-Gehalt normaliséiert. BHI: bioenergetesche Gesondheetsindex; SRC: Atmungsreservekapazitéit; OCR: Sauerstoffverbrauchsquote. D'Donnéeë ginn als Moyenne ± Standardofwäichung (SD) duergestallt, n = 5 onofhängeg Experimenter. Statistesch Vergläicher goufen mat One-Way ANOVA an dem Bonferroni Post-hoc Test duerchgefouert. *p < 0,05; **p < 0,01; an ***p < 0,001
Fir e méi ëmfaassend Verständnis vum Effekt vun IPA op de bioenergetesche Profil vun TGF-β1-aktivéierten LX-2 Zellen ze kréien, hu mir déi mitochondrial oxidativ Phosphoryléierung duerch OCR analyséiert (Fig. 3C,D). D'Resultater hunn gewisen, datt d'TGF-β1 Behandlung déi maximal Atmung, d'Atmungsreservekapazitéit (SRC) an de BHI am Verglach mat der Kontrollgrupp reduzéiere konnt (Fig. 3C,D). Zousätzlech huet d'Kombinatiounsbehandlung d'Basalatmung, de Protonenleck an d'ATP-Produktioun reduzéiert, awer SRC a BHI ware wesentlech méi héich wéi déi, déi mat TGF-β1 behandelt goufen (Fig. 3C,D).
Mir hunn och den "Cellular Energy Phenotype Test" vun der Seahorse Software duerchgefouert (Supplementary Fig. 4A-D). Wéi an der Supplementary Fig. 3B gewisen, waren souwuel d'OCR- wéi och d'ECAR-Metabolismuspotenzialer no der TGF-β1-Behandlung erofgaangen, awer et gouf keen Ënnerscheed an der Kombinatiouns- an der IPA-Behandlungsgrupp am Verglach mat der Kontrollgrupp observéiert. Ausserdeem waren souwuel d'Basal- wéi och d'Stressniveauen vun OCR no der Kombinatiouns- an IPA-Behandlung am Verglach mat der Kontrollgrupp erofgaangen (Supplementary Fig. 4C). Interessanterweis gouf e ähnlecht Muster mat der Kombinatiounstherapie observéiert, wou keng Ännerung vun de Basal- a Stressniveauen vun ECAR am Verglach mat der TGF-β1-Behandlung observéiert gouf (Supplementary Fig. 4C). Bei HSCs huet d'Reduktioun vun der mitochondrialer oxidativer Phosphoryléierung an d'Fäegkeet vun der Kombinatiounsbehandlung, SCR a BHI no der Belaaschtung mat TGF-β1-Behandlung ze restauréieren, de metabolesche Potenzial net verännert (OCR an ECAR). Zesummegeholl weisen dës Resultater drop hin, datt IPA d'Bioenergetik an HSCs reduzéiere kann, wat drop hiweist, datt IPA e méi nidderegen energetesche Profil induzéiere kann, deen den HSC-Phänotyp a Richtung Inaktivéierung verréckelt (Supplementary Figur 4D).
Den Effekt vun IPA op d'Mitochondriendynamik gouf mat Hëllef vun enger dräidimensionaler Quantifizéierung vun der mitochondrialer Morphologie a Netzwierkverbindungen, souwéi MTR-Färbung, ënnersicht (Figur 4 an Ergänzungsfigur 5). Figur 4 weist, datt d'TGF-β1-Behandlung am Verglach mat der Kontrollgrupp déi duerchschnëttlech Uewerfläch, d'Zweigzuel, d'Gesamtzweiglängt an d'Zweigverbindungszuel reduzéiert huet (Figur 4A an B) an den Undeel vun de Mitochondrien vun enger sphärescher op eng intermediär Morphologie geännert huet (Figur 4C). Nëmmen d'IPA-Behandlung huet dat duerchschnëttlecht Mitochondrienvolumen reduzéiert an den Undeel vun de Mitochondrien vun enger sphärescher op eng intermediär Morphologie am Verglach mat der Kontrollgrupp geännert (Figur 4A). Am Géigesaz dozou sinn d'Kugelzität, d'duerchschnëttlech Zweiglängt an d'Mitochondrienaktivitéit, déi duerch mitochondrial Membranpotential-ofhängeg MTR bewäert goufen (Figur 4A an E), onverännert bliwwen an dës Parameter hunn sech net tëscht de Gruppen ënnerscheet. Zesummegeholl suggeréieren dës Resultater, datt d'TGF-β1- an d'IPA-Behandlung d'Form a Gréisst vun de Mitochondrien, souwéi d'Netzwierkkomplexitéit a liewegen LX-2-Zellen, moduléieren ze kënnen.
IPA ännert d'Mitochondriendynamik an d'Heefegkeet vun der mitochondrialer DNA an LX-2 Zellen. A. Representativ konfokal Biller vu liewegen LX-2 Zellen, déi mat TGF-β1 (5 ng/ml) an 1 mM IPA fir 24 Stonnen a serumfräiem Medium inkubéiert goufen, déi mitochondrial Netzwierker weisen, déi mat Mitotracker™ Red CMXRos gefierft goufen, an Zellkären, déi blo mat DAPI gefierft goufen. All Donnéeën enthalen op d'mannst 15 Biller pro Grupp. Mir hunn 10 Z-Stack Biller fir all Prouftyp kritt. All Z-Achssequenz enthält 30 Scheiwen, all mat enger Déckt vun 9,86 μm. Skala: 10 μm. B. Representativ Objeten (nëmme Mitochondrien), déi duerch d'Uwendung vun adaptiven Schwellwäerter op d'Bild identifizéiert goufen. Quantitativ Analyse a Verglach vu mitochondrial morphologeschen Netzwierkverbindunge goufen fir all Zellen an all Grupp duerchgefouert. C. Frequenz vun de mitochondrial Formverhältnisser. Wäerter no bei 0 weisen sphäresch Formen un, a Wäerter no bei 1 weisen filamentös Formen un. D Den Inhalt vun der mitochondrialer DNA (mtDNA) gouf wéi a Materialien a Methoden beschriwwen bestëmmt. D'E Mitotracker™ Red CMXRos Analyse gouf duerch Flusszytometrie (30.000 Evenementer) duerchgefouert, wéi a Materialien a Methoden beschriwwen. D'Donnéeë ginn als Moyenne ± SD presentéiert, n = 3 onofhängeg Experimenter. Statistesch Vergläicher goufe mat Hëllef vun engem One-Way ANOVA an dem Bonferroni Post-hoc Test duerchgefouert. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Mir hunn duerno den mtDNA-Gehalt an den LX-2 Zellen als Indikator fir d'Zuel vun de Mitochondrien analyséiert. Am Verglach mat der Kontrollgrupp war den mtDNA-Gehalt an der Grupp, déi mat TGF-β1 behandelt gouf, erhéicht (Figur 4D). Am Verglach mat der Grupp, déi mat TGF-β1 behandelt gouf, war den mtDNA-Gehalt an der Grupp, déi mat der Kombinatiounsbehandlung behandelt gouf, erofgaangen (Figur 4D), wat drop hiweist, datt IPA den mtDNA-Gehalt a méiglecherweis d'Zuel vun de Mitochondrien souwéi d'mitochondrialer Atmung reduzéiere kéint (Figur 3C). Ausserdeem schéngt IPA den mtDNA-Gehalt an der Kombinatiounsbehandlung ze reduzéieren, awer huet d'MTR-vermittelte Mitochondrienaktivitéit net beaflosst (Figuren 4A-C).
Mir hunn den Zesummenhang vun IPA mat den mRNA-Niveauen vu Genen ënnersicht, déi mat Fibrose, Apoptose, Iwwerliewe a mitochondrialer Dynamik an LX-2 Zellen assoziéiert sinn (Figur 5A–D). Am Verglach mat der Kontrollgrupp huet d'TGF-β1-behandelt Grupp eng erhéicht Expressioun vu Genen wéi Kollagen Typ I α2 Kette (COL1A2), α-Glattmuskelaktin (αSMA), Matrixmetalloproteinase 2 (MMP2), Tissue-Inhibitor vun der Metalloproteinase 1 (TIMP1) an Dynamin 1-ähnlechem Gen (DRP1) gewisen, wat op eng erhéicht Fibrose an Aktivatioun hiweist. Ausserdeem huet d'TGF-β1 Behandlung am Verglach mat der Kontrollgrupp d'mRNA-Niveauen vum nukleare Pregnan X Rezeptor (PXR), Caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, Inhibitor vun der B-Zell α, Enhancer vum Nuklearfaktor κ Gen Liichtpeptid (NFκB1A) an Inhibitor vun der Nuklearfaktor κB Kinase Ënnereenheet β (IKBKB) reduzéiert (Figur 5A–D). Am Verglach mat der TGF-β1-Behandlung huet d'Kombinatiounsbehandlung mat TGF-β1 an IPA d'Expressioun vu COL1A2 an MMP2 reduzéiert, awer d'mRNA-Niveaue vu PXR, TIMP1, B-Zell-Lymphom-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β an IKBKB erhéicht. D'IPA-Behandlung huet d'Expressioun vun MMP2, Bcl-2-assoziéiertem Protein X (BAX), AKT1, optescher Atrophieprotein 1 (OPA1) a mitochondrieller Fusiounsprotein 2 (MFN2) signifikant reduzéiert, während d'Expressioun vu CASP8, NFκB1A, NFκB1B an IKBKB am Verglach mat der Kontrollgrupp erhéicht war. Wéi och ëmmer, gouf keen Ënnerscheed an der Expressioun vu Caspase-3 (CASP3), apoptotesche Peptidase-aktivéierende Faktor 1 (APAF1), mitochondrieller Fusiounsprotein 1 (MFN1) a Spaltungsprotein 1 (FIS1) festgestallt. Zesummegefaasst suggeréieren dës Resultater, datt d'IPA-Behandlung d'Expressioun vu Genen moduléiert, déi mat Fibrose, Apoptose, Iwwerliewe a mitochondrialer Dynamik verbonne sinn. Eis Donnéeë suggeréieren, datt d'IPA-Behandlung d'Fibrose an LX-2 Zellen reduzéiert; gläichzäiteg stimuléiert se d'Iwwerliewe andeems se de Phenotyp a Richtung Inaktivatioun verréckelt.
IPA moduléiert d'Expressioun vu Fibroblast-, Apoptotik-, Viabilitéits- a Mitochondriendynamik-Genen an LX-2 Zellen. Histogrammer weisen d'mRNA-Expressioun am Verhältnes zu der endogener Kontroll (RPLP0 oder PPIA) nodeems LX-2 Zellen 24 Stonnen mat TGF-β1 an IPA a serumfräie Medium induzéiert goufen. A weist Fibroblasten un, B weist apoptotesch Zellen un, C weist iwwerliewend Zellen un, an D weist Mitochondriendynamik-Genexpressioun un. D'Donnéeë ginn als Moyenne ± Standardofwäichung (SD) presentéiert, n = 3 onofhängeg Experimenter. Statistesch Vergläicher goufen mat Hëllef vun engem One-Way-ANOVA an dem Bonferroni Post-hoc-Test duerchgefouert. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Duerno goufen d'Ännerungen an der Zellgréisst (FSC-H) an der zytoplasmatescher Komplexitéit (SSC-H) duerch Flusszytometrie bewäert (Figur 6A,B), an d'Ännerungen an der Zellmorphologie no der IPA-Behandlung goufen duerch Transmissiounselektronemikroskopie (TEM) a Phasenkontrastmikroskopie bewäert (Ergänzungsfigur 6A-B). Wéi erwaart, sinn d'Zellen an der mat TGF-β1 behandelter Grupp am Verglach mat der Kontrollgrupp méi grouss ginn (Figur 6A,B), wat déi klassesch Expansioun vum raue endoplasmatesche Retikulum (ER*) a Phagolysosomen (P) weist, wat op d'Aktivatioun vun hämatopoetesche Stammzellen (HSC) hiweist (Ergänzungsfigur 6A). Am Verglach mat der mat TGF-β1 behandelter Grupp waren awer d'Zellgréisst, d'zytoplasmatesch Komplexitéit (Fig. 6A,B) an den ER*-Gehalt an der TGF-β1 an IPA-Kombinatiounsbehandlungsgrupp erofgaang (Ergänzungsfigur 6A). Ausserdeem huet d'IPA-Behandlung d'Zellgréisst, d'zytoplasmatesch Komplexitéit (Fig. 6A,B), den P- an den ER*-Gehalt (Ergänzungsfigur 6A) am Verglach mat der Kontrollgrupp reduzéiert. Zousätzlech ass den Undeel vun apoptoteschen Zellen no 24 Stonnen IPA-Behandlung am Verglach mat der Kontrollgrupp eropgaang (wäiss Pfeiler, Ergänzungsfigur 6B). Zesummegefaasst suggeréieren dës Resultater, datt 1 mM IPA d'HSC-Apoptose stimuléiere kann an d'Verännerungen an de morphologesche Parameteren vun den Zellen, déi duerch TGF-β1 induzéiert ginn, ëmdréine kann, wouduerch d'Zellgréisst a Komplexitéit reguléiert ginn, wat mat der HSC-Inaktivéierung verbonne ka sinn.
IPA ännert d'Zellgréisst an d'zytoplasmatesch Komplexitéit an LX-2 Zellen. Representativ Biller vun der Flowcytometrie-Analyse. D'Analyse huet eng Gating-Strategie benotzt, déi spezifesch fir LX-2 Zellen ass: SSC-A/FSC-A fir d'Zellpopulatioun ze definéieren, FSC-H/FSC-A fir Doubletten z'identifizéieren, an SSC-H/FSC-H fir d'Zellgréisst- a Komplexitéitsanalyse. D'Zellen goufen 24 Stonnen mat TGF-β1 (5 ng/ml) an 1 mM IPA a serumfräie Medium inkubéiert. LX-2 Zellen goufen an den ënneschte lénkse Quadrant (SSC-H-/FSC-H-), den ieweschte lénkse Quadrant (SSC-H+/FSC-H-), den ënneschte rietse Quadrant (SSC-H-/FSC-H+) an den ieweschte rietse Quadrant (SSC-H+/FSC-H+) fir d'Zellgréisst- a zytoplasmatesch Komplexitéitsanalyse verdeelt. B. D'Zellmorphologie gouf duerch Flowcytometrie mat FSC-H (Forward Scatter, Zellgréisst) an SSC-H (Säite-Street, zytoplasmatesch Komplexitéit) analyséiert (30.000 Eventer). D'Donnéeë ginn als Moyenne ± SD presentéiert, n = 3 onofhängeg Experimenter. Statistesch Vergläicher goufe mat Hëllef vun engem One-Way-ANOVA an dem Bonferroni Post-hoc-Test duerchgefouert. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 an ****p < 0,0001
Darmmetabolitte wéi IPA sinn zu engem aktuellen Fuerschungsthema ginn, wat drop hiweist, datt nei Ziler an der Darmflora entdeckt kënne ginn. Et ass dofir interessant, datt IPA, e Metabolit, deen mir mat Liewerfibrose beim Mënsch a Verbindung bruecht hunn [15], an Déiermodeller als potenziell antifibrotesch Verbindung gewisen huet [13, 14]. Hei demonstréiere mir fir d'éischt Kéier eng Associatioun tëscht Serum-IPA a globaler Liewertranskriptomik an DNA-Methylierung bei fettleibegen Individuen ouni Typ-2-Diabetis (T2D), wat Apoptose, Mitophagie a Langlebigkeet ervirhieft, souwéi e méigleche Kandidatgen AKT1, deen d'Liewerhomöostase reguléiert. Eng aner Neiheet vun eiser Studie ass, datt mir d'Interaktioun vun der IPA-Behandlung mat Apoptose, Zellmorphologie, mitochondrialer Bioenergetik an Dynamik an LX-2 Zellen demonstréiert hunn, wat op e méi nidderegen Energiespektrum hiweist, deen den HSC-Phänotyp a Richtung Inaktivéierung verréckelt, wat IPA zu engem potenziellen Kandidat fir d'Verbesserung vun der Liewerfibrose mécht.
Mir hunn festgestallt, datt Apoptose, Mitophagie a Langlebigkeit déi wichtegst kanonesch Weeër waren, déi a Liewergenen beräichert goufen, déi mat zirkulierendem Serum IPA verbonne sinn. Eng Stéierung vum mitochondrialen Qualitéitskontrollsystem (MQC) kann zu enger mitochondrialer Dysfunktioun, Mitophagie an Apoptose féieren, wouduerch d'Optriede vu MASLD gefördert gëtt [33, 34]. Dofir kënne mir spekuléieren, datt IPA un der Erhalen vun der Zelldynamik an der mitochondrialer Integritéit duerch Apoptose, Mitophagie a Langlebigkeit an der Liewer bedeelegt ka sinn. Eis Donnéeën hunn gewisen, datt zwou Genen an den dräi Tester gemeinsam waren: YKT6 an AKT1. Et ass derwäert ze bemierken, datt YKT6 e SNARE-Protein ass, dat am Prozess vun der Zellmembranfusioun bedeelegt ass. Et spillt eng Roll an der Autophagie a Mitophagie andeems et en Initiatiounskomplex mat STX17 an SNAP29 um Autophagosom bildt, wouduerch d'Fusioun vun Autophagosomen a Lysosomen gefördert gëtt [35]. Ausserdeem féiert de Verloscht vun der YKT6-Funktioun zu enger gestéierter Mitophagie[36], während d'Upreguléierung vun YKT6 mat der Progressioun vum hepatozelluläre Karzinom (HCC) assoziéiert ass, wat e erhéicht Zellüberliewe weist[37]. Op der anerer Säit ass AKT1 dat wichtegst interagéierend Gen a spillt eng wichteg Roll bei Liewerkrankheeten, dorënner de PI3K/AKT-Signalwee, Zellzyklus, Zellmigratioun, Proliferatioun, Fokaladhäsioun, Mitochondriefunktioun a Kollagensekretioun[38–40]. Den aktivéierte PI3K/AKT-Signalwee kann hämatopoetesch Stammzellen (HSCs) aktivéieren, déi d'Zellen sinn, déi fir d'Produktioun vun extrazellulärer Matrix (ECM) verantwortlech sinn, a seng Dysreguléierung kann zum Optriede a Progressioun vu Liewerfibrose bäidroen[40]. Zousätzlech ass AKT ee vun de Schlësselfaktoren fir d'Zellüberliewe, déi p53-ofhängeg Zellapoptose hemmen, an d'AKT-Aktivéierung kann mat der Hemmung vun der Liewerzellapoptose assoziéiert sinn[41, 42]. Déi kritt Resultater suggeréieren, datt IPA an der Liewermitochondrien-assoziéierter Apoptose involvéiert ka sinn, andeems et d'Entscheedung vun Hepatozyten tëscht dem Antrëtt an d'Apoptose oder dem Iwwerliewe beaflosst. Dës Effekter kënne vun AKT- an/oder YKT6-Kandidatgenen reguléiert ginn, déi entscheedend fir d'Liewerhomöostase sinn.
Eis Resultater hunn gewisen, datt 1 mM IPA Apoptose induzéiert an d'mitochondrial Atmung an LX-2 Zellen onofhängeg vun der TGF-β1 Behandlung reduzéiert huet. Et ass bemierkenswäert, datt Apoptose e wichtege Wee fir d'Fibrose-Opléisung an d'Aktivéierung vun hämatopoetesche Stammzellen (HSC) ass, an och e Schlësselevenement an der reversibler physiologescher Äntwert op Liewerfibrose ass [4, 43]. Ausserdeem huet d'Restauratioun vum BHI an LX-2 Zellen no der Kombinatiounsbehandlung nei Abléck an déi potenziell Roll vun IPA an der Reguléierung vun der mitochondrialer Bioenergetik geliwwert. Ënner Rou- an inaktiven Bedingungen benotzen hämatopoetesch Zellen normalerweis mitochondrial oxidativ Phosphoryléierung fir ATP ze produzéieren an hunn eng niddreg metabolesch Aktivitéit. Op der anerer Säit verbessert d'HSC-Aktivéierung d'mitochondrial Atmung a Biosynthese fir den Energiebedarf beim Antrëtt an de glykolyteschen Zoustand ze kompenséieren [44]. D'Tatsaach, datt IPA keen Afloss op de metabolesche Potenzial hat an den ECAR, seet vir, datt de glykolytesche Wee manner prioritär behandelt gëtt. Ähnlech huet eng aner Studie gewisen, datt 1 mM IPA fäeg war, d'Aktivitéit vun der mitochondrialer Atmungskette a Kardiomyozyten, mënschlecher Hepatozytenzellinn (Huh7) an mënschlechen Nabelvenenendothelzellen (HUVEC) ze moduléieren; Wéi och ëmmer, gouf keen Effekt vun IPA op d'Glykolyse a Kardiomyozyten fonnt, wat drop hiweist, datt IPA d'Bioenergetik vun aneren Zelltypen beaflosse kéint [45]. Dofir spekuléiere mir, datt 1 mM IPA als e mëllen chemeschen Entkoppler kéint wierken, well et d'fibrogen Genexpression, d'Zellmorphologie an d'mitochondrial Bioenergetik däitlech reduzéiere kann, ouni d'Quantitéit vun der mtDNA ze änneren [46]. Mitochondrial Entkoppler kënnen d'Kultur-induzéiert Fibrose an d'HSC-Aktivatioun hemmen [47] an d'mitochondrial ATP-Produktioun reduzéieren, déi duerch bestëmmte Proteinen wéi Entkopplungsproteinen (UCP) oder Adeninnukleotid-Translokase (ANT) reguléiert oder induzéiert gëtt. Ofhängeg vum Zelltyp kann dëst Phänomen Zellen virun Apoptose schützen an/oder Apoptose förderen [46]. Wéi och ëmmer, weider Studien sinn néideg fir d'Roll vun IPA als mitochondrialen Entkoppler bei der Inaktivatioun vun hämatopoetesche Stammzellen ze klären.
Mir hunn duerno ënnersicht, ob d'Verännerungen an der mitochondrialer Atmung sech an der mitochondrialer Morphologie a liewegen LX-2 Zellen reflektéieren. Interessanterweis ännert d'TGF-β1 Behandlung de mitochondriale Proportioun vu sphärescher op intermediärer Form, mat enger reduzéierter mitochondrialer Verzweigung an enger erhéichter Expressioun vun DRP1, engem Schlësselfaktor bei der mitochondrialer Spaltung [48]. Ausserdeem ass d'mitochondrialer Fragmentatioun mat der allgemenger Netzwierkkomplexitéit assoziéiert, an den Iwwergang vu Fusioun zu Spaltung ass entscheedend fir d'Aktivatioun vun hämatopoetesche Stammzellen (HSC), während d'Inhibitioun vun der mitochondrialer Spaltung zu HSC-Apoptose féiert [49]. Dofir weisen eis Resultater drop hin, datt d'TGF-β1 Behandlung eng Ofsenkung vun der mitochondrialer Netzwierkkomplexitéit mat reduzéierter Verzweigung induzéiere kann, wat méi heefeg bei der mitochondrialer Spaltung assoziéiert mat aktivéierten hämatopoetesche Stammzellen (HSCs). Ausserdeem hunn eis Donnéeën gewisen, datt IPA de Proportioun vun de Mitochondrien vu sphärescher op intermediärer Form änneren kéint, wouduerch d'Expressioun vun OPA1 an MFN2 reduzéiert gëtt. Studien hunn gewisen, datt d'Downreguléierung vun OPA1 eng Ofsenkung vum mitochondrialer Membranpotenzial verursaache kéint an Zellapoptose ausléise kéint [50]. Et ass bekannt, datt MFN2 mitochondrialer Fusioun an Apoptose vermittelt [51]. Déi kritt Resultater suggeréieren, datt d'Induktioun vun LX-2 Zellen duerch TGF-β1 an/oder IPA d'Form a Gréisst vun de Mitochondrien, souwéi den Aktivéierungszoustand an d'Komplexitéit vum Netzwierk, moduléiert.
Eis Resultater weisen drop hin, datt d'Kombinatiounsbehandlung vun TGFβ-1 an IPA mtDNA a morphologesch Parameter vun den Zellen reduzéiere kann, andeems se d'mRNA-Expressioun vu Fibrose, Apoptose a mat Iwwerliewe verbonne Genen an Zellen reguléiert, déi Apoptose vermeiden. Tatsächlech huet IPA den mRNA-Expressiounsniveau vun AKT1 a wichtege Fibrose-Genen wéi COL1A2 an MMP2 reduzéiert, awer den Expressiounsniveau vu CASP8 erhéicht, wat mat Apoptose assoziéiert ass. Eis Resultater weisen, datt no der IPA-Behandlung d'BAX-Expressioun erofgaangen ass an d'mRNA-Expressioun vun den TIMP1-Familljenënnereenheeten, BCL-2 an NF-κB eropgaangen ass, wat drop hiweist, datt IPA Iwwerliewenssignaler an hämatopoetesche Stammzellen (HSCs) stimuléiere kann, déi der Apoptose vermeiden. Dës Moleküle kënnen als pro-Iwwerliewenssignaler an aktivéierten hämatopoetesche Stammzellen handelen, wat mat enger erhéichter Expressioun vun anti-apoptotesche Proteinen (wéi Bcl-2), enger reduzéierter Expressioun vu pro-apoptotesche BAX an engem komplexen Zesummenspill tëscht TIMP an NF-κB assoziéiert ka sinn [5, 7]. IPA übt seng Effekter duerch PXR aus, a mir hunn festgestallt, datt d'Kombinatiounsbehandlung mat TGF-β1 an IPA d'PXR mRNA-Expressiounsniveauen erhéicht huet, wat op d'Ënnerdréckung vun der HSC-Aktivatioun hiweist. Aktivéiert PXR-Signalgebung ass bekannt dofir, datt se d'HSC-Aktivatioun souwuel in vivo wéi och in vitro hemmt [52, 53]. Eis Resultater weisen drop hin, datt IPA un der Eliminatioun vun aktivéierten HSCs deelhuele kann, andeems et d'Apoptose fördert, d'Fibrose an de mitochondriale Metabolismus reduzéiert an d'Iwwerliewenssignaler verbessert, wat typesch Prozesser sinn, déi den aktivéierten HSC-Phänotyp an en inaktivéierten ëmwandelen. Eng aner méiglech Erklärung fir de potenziellen Mechanismus an d'Roll vun IPA bei der Apoptose ass, datt et dysfunktionell Mitochondrien haaptsächlech duerch Mitophagie (intrinsesche Wee) an den extrinsesche TNF-Signalwee (Tabell 1) erniert, deen direkt mam NF-κB-Iwwerliewenssignalwee verbonnen ass (Ergänzungsfigur 7). Interessanterweis kënnen IPA-verbonne beräichert Genen pro-apoptotesch a pro-Iwwerliewenssignaler am apoptotesche Wee induzéieren [54], wat drop hiweist, datt IPA den apoptotesche Wee oder d'Iwwerliewe induzéiere kann, andeems et mat dëse Genen interagéiert. Wéi IPA Apoptose oder d'Iwwerliewe während der HSC-Aktivatioun induzéiert a seng mechanistesch Weeër bleiwen awer onkloer.
IPA ass e mikrobiellen Metabolit, deen aus Tryptophan am Nahrungsergänzungsmittel iwwer d'Darmflora geformt gëtt. Studien hunn gewisen, datt et entzündungshemmend, antioxidant an epigenetesch regulatoresch Eegeschaften an der Darmëmfeld huet.[55] Studien hunn gewisen, datt IPA d'Darmbarriärfunktioun moduléiere kann an oxidativen Stress reduzéiere kann, wat zu senge lokale physiologeschen Effekter bäidroe kann.[56] Tatsächlech gëtt IPA iwwer de Bluttkreeslaf an d'Zilorganer transportéiert, an well IPA eng ähnlech Haaptmetabolitstruktur mat Tryptophan, Serotonin an Indolderivater deelt, übt IPA metabolesch Aktiounen aus, déi zu kompetitive metabolesche Schicksaler féieren.[52] IPA kéint mat Tryptophan-ofgeleete Metabolitten ëm Bindungsplazen op Enzymen oder Rezeptoren konkurréieren, wat potenziell normal metabolesch Weeër stéiere kann. Dëst ënnersträicht d'Noutwennegkeet vu weidere Studien iwwer seng Pharmakokinetik a Pharmakodynamik, fir säin therapeutescht Fënster besser ze verstoen.[57] Et bleift ofzewaarden, ob dëst och an hämatopoetesche Stammzellen (HSCs) optriede kann.
Mir erkennen un, datt eis Studie e puer Aschränkungen huet. Fir spezifesch Associatiounen am Zesummenhang mat IPA z'ënnersichen, hu mir Patienten mat Typ-2-Diabetis mellitus (T2DM) ausgeschloss. Mir erkennen un, datt dëst déi breet Uwendung vun eise Resultater op Patienten mat Typ-2-Diabetis mellitus a fortgeschratt Liewerkrankheet limitéiert. Obwuel déi physiologesch Konzentratioun vun IPA am mënschleche Serum 1–10 μM ass [11, 20], gouf eng Konzentratioun vun 1 mM IPA op Basis vun der héchster net-gëfteger Konzentratioun [15] an der héchster Apoptosequote gewielt, ouni Ënnerscheed am Prozentsaz vun der nekrotescher Zellpopulatioun. Obwuel supraphysiologesch Niveauen vun IPA an dëser Studie benotzt goufen, gëtt et de Moment kee Konsens iwwer déi effektiv Dosis vun IPA [52]. Och wann eis Resultater bedeitend sinn, bleift dat méi breet metabolescht Schicksal vun IPA en aktiven Fuerschungsberäich. Ausserdeem goufen eis Resultater iwwer d'Associatioun tëscht Serum-IPA-Niveauen an DNA-Methylierung vu Liewertranskripten net nëmme vun hämatopoetesche Stammzellen (HSCs) kritt, mä och aus Liewergewebe. Mir hunn eis dofir entscheet, mënschlech LX-2 Zellen ze benotzen, baséiert op eise fréiere Befunde vun der Transkriptomanalyse, datt IPA mat der Aktivatioun vun hämatopoetesche Stammzellen (HSC) assoziéiert ass [15], an HSCs déi wichtegst Zellen sinn, déi un der Progressioun vun der Liewerfibrose bedeelegt sinn. D'Liewer besteet aus verschiddene Zelltypen, dofir sollten aner Zellmodeller, wéi z. B. den Hepatozyten-HSC-Immunzell-Kokultursystem a Kombinatioun mat Caspase-Aktivatioun an DNA-Fragmentéierung, souwéi de Wierkungsmechanismus, inklusiv dem Proteinniveau, berécksiichtegt ginn, fir d'Roll vun IPA a seng Interaktioun mat anere Liewerzelltypen ze studéieren.