D'Proteinsortéierung am Sekretiounswee ass essentiell fir d'Zellkompartimentaliséierung an d'Homöostase z'erhalen. Nieft der Schuel-vermittelter Sortéierung ass d'Roll vun de Lipiden beim Kinesinsortéierung am Prozess vum sekretoreschen Transport eng laangjäreg fundamental Fro, déi nach net beäntwert gouf. Hei maache mir 3D simultan Multicolor-Héichopléisungs-Echtzäit-Bildgebung, fir in vivo ze beweisen, datt nei synthetiséiert Glycosylphosphatidylinositol-immobiliséiert Proteine ​​mat ganz laange Ceramid-Lipid-Eenheeten geklautert an a spezialiséiert Endoplasma-Net-Exit-Site klasséiert sinn, wat anescht ass wéi dee, deen vun transmembrane Proteine ​​benotzt gëtt. Zousätzlech weisen mir, datt d'Kettenlängt vum Ceramid an der Membran vum endoplasmatesche Retikulum entscheedend fir dës Sortéierungsselektivitéit ass. Eis Studie liwwert den éischten direkten in vivo Beweis fir Proteinladungen op Basis vun der Lipidkettenlängt a selektiv Exportplazen am Sekretiounswee ze klassifizéieren.
An eukaryoteschen Zellen ginn d'Proteinen, déi am endoplasmatesche Retikulum (ER) synthetiséiert ginn, dann während dem Transport duerch de sekretoresche Wee fir d'Liwwerung un hir entspriechend zellulär Destinatioun sortéiert (1). Zousätzlech zu der Mantel-vermittelter Sortéierung gouf laang spekuléiert, datt verschidde Lipiden och als selektiv Ausgangspunkten dénge kënnen, andeems se a spezifesch Membrandomänen, déi spezifesch Proteinen, gruppéiert ginn (2-5). Wéi och ëmmer, et feelt nach ëmmer un direkten in vivo Beweiser fir dëse méigleche lipidbaséierte Mechanismus ze beweisen. Fir dëst Basisproblem ze léisen, hu mir an Hef ënnersicht, wéi Glycosylphosphatidylinositol (GPI) verankert Proteinen (GPI-APs) differenziell aus dem ER exportéiert ginn. GPI-APs sinn eng Vielfalt vu lipidverbonne Zelluewerflächeproteinen (6, 7). GPI-AP ass e sekretéiert Protein, dat un déi äusser Blieder vun der Plasmamembran duerch d'Glykolipid-Eenheet (GPI-Anker) befestegt ass. Si akzeptéieren GPI-Anker als konservativ posttranslational Modifikatiounen am ER-Lumen (8). Nom Uschloss geet GPI-AP duerch den Golgi-Apparat (5, 9) vum ER an d'Plasmamembran. D'Präsenz vun GPI-Anker bewierkt, datt GPI-AP getrennt vun transmembran sekretéierte Proteinen (inklusiv aner Plasmamembranproteinen) laanscht de sekretoresche Wee transportéiert gëtt (5, 9, 10). An Hefezellen ginn GPI-APs vun anere sekretéierte Proteinen am endoplasmatesche Retikulum getrennt an dann a speziell Vesikelen verpackt, déi duerch Mantelproteinkomplex II (COPII) agewéckelt sinn (6, 7). D'Determinanten vun dësem Klassifikatiounsprozess am ER-Exportprozess sinn net kloer, awer et gëtt spekuléiert, datt dëse Mechanismus Lipiden erfuerdert, besonnesch d'strukturell Ëmbauung vum Lipiddeel vum GPI-Anker (5, 8). An Hef fänkt d'GPI-Lipidëmbau direkt no der Uschlossung vum GPI un, an a ville Fäll bewierkt et, datt Ceramid sech un déi 26-Kuelestoffatom laangketteg gesättigte Fettsäure (C26:0) bindt (11, 12). C26-Ceramid ass dat Haaptceramid, dat bis elo vun Hefezellen produzéiert gëtt. Et gëtt am ER synthetiséiert an de gréissten Deel dovun gëtt iwwer COPII-Vesikelen an de Golgi-Apparat exportéiert (13). Den ER-Export vu GPI-AP erfuerdert speziell eng lafend Ceramidsynthese (14, 15), an domat hänkt d'Ëmwandlung vu Ceramid an Inositolphosphatceramid (IPC) am Golgi-Apparat vun der GPI-Ankersynthese of (16). Biophysikalesch Studien mat künstlechen Membranen hunn gewisen, datt ganz laang Acylkette-Ceramiden zesummelafe kënnen, fir geuerdnet Domänen mat eenzegaartege physikaleschen Eegeschaften ze bilden (17, 18). Dës Donnéeë féieren zur Hypothese, datt C26-Ceramid a GPI-AP mat C26-Ceramid hir physikalesch Eegeschafte benotzen, fir sech an geuerdnete Regiounen oder Regiounen an der relativ chaotischer ER-Membran-Lipidëmfeld zesummenzeféieren. Et besteet haaptsächlech aus kuerzen an ongesiedegte Glycerolipiden (C16:1 an C18:1) (19, 20). Dës Regioune ginn selektiv op spezifesch ER-Ausgangsplazen (ERES) fokusséiert, wou Ceramid a Ceramid-baséiert GPI-AP an der selwechter dedizéierter COPII-Vesikel zesumme mam Golgi transportéiert kënne ginn (5).
An dëser Studie hu mir dëse lipidbaséierte Mechanismus direkt getest andeems mir Super-Resolution confocal Real-Time Imaging Microscopy (SCLIM) benotzt hunn, eng modern Mikroskopietechnik déi gläichzäiteg fluoreszent markéiert Proteinen observéiere kann. Déi dräifaarweg an dräidimensional (3D) Biller hunn extrem héich Opléisung a Geschwindegkeet a liewegen Zellen (21, 22).
Mir hunn d'SCLIM-Technologie fir d'éischt ugewannt, fir weider ze definéieren, wéi normal GPI-AP mat der C26-Ceramidgrupp aus transmembran sekretéierte Proteinen gescreent gouf, nodeems se den ER an S. cerevisiae verlooss hunn. Fir d'Klassifikatioun vum ER ze kontrolléieren, hu mir e genetescht System benotzt, dat direkt nei synthetiséiert Cargo, déi an den ERES erakënnt, in vivo visualiséiere kann (7, 23). Als Cargo hu mir C26-Ceramid-baséiert GPI-AP Gas1, markéiert mat gréngem fluoreszentem Protein (GFP), an transmembran sekretéiert Protein Mid2, markéiert mat noen Infraroutfluoreszentem Protein (iRFP), gewielt, déi allebéid d'Plasmamembran zielen (24-26). Am temperaturempfindleche Mutant sec31-1 ginn dës zwou Cargoen ënner engem Galaktose-induzéierbare Promotor an engem konstitutive ERES-Marker expriméiert. Bei der extremer Temperatur (37°C), well d'sec31-1-Mutatioun d'Funktioun vun der COPII-Mantelkomponent Sec31 beaflosst, fir d'COPII-Keimung an den ER-Export ze hemmen, accumuléiert sech nei synthetiséiert Cargo am ER (23). Nodeem se op eng niddreg Temperatur (24°C) ofgekillt waren, hunn sech d'sec31-1-Mutantzellen aus dem Sekretiounsberäich erholl, an déi akkumuléiert nei synthetesch Ladung huet ugefaangen, aus dem ER exportéiert ze ginn. D'CLIM-Visualiséierung huet gewisen, datt de gréissten Deel vum nei synthetiséierte Gas1-GFP a Mid2-iRFP sech no der Inkubatioun bei 37°C nach ëmmer am ER vun den sec31-1-Mutantzellen accumuléiert huet an duerno bei 24°C fir 5 Minutten fräigesat gouf (Figur 1). Well Mid2-iRFP op der ganzer ER-Membran verdeelt ass, a Gas1-GFP konzentréiert a gesammelt ass am diskontinuéierlechen ER-Membranberäich, ass hir Verdeelung komplett anescht (Figur 1, A bis C a Film S1). Zousätzlech, wéi an der Figur 1D gewisen, huet de Gas1-GFP-Cluster kee Mid2-iRFP. Dës Resultater weisen drop hin, datt GPI-AP an Transmembranproteine ​​fréi an ënnerschiddlech ER-Membranregiounen getrennt goufen. De Gas1-GFP Cluster läit nieft engem spezifeschen ERES, deen mam mCherry sengem COPII-Mantelprotein Sec13 markéiert ass (Figur 1, E an F, a Film S1) (23).
sec31-1 Zellen expriméieren Galaktose-induzéiert Sekretiounen, e laangt Acylkette (C26) Ceramid GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, gréng) an den Transmembranprotein Mid2-iRFP (TMP, blo) an dës konstruktiv ERES-Markéierung Sec13-mCherry (ERES, magenta) gouf 30 Minutten bei 37°C inkubéiert, op 24°C geréckelt an 5 Minutte méi spéit mam SCLIM ofgebildt. (A bis C) weist e representativt zesummegefaasst oder eenzel 2D-Bild vun enger Fläch (A), en 2D-Projektiounsbild vun 10 z-Schnëtter (B) oder en 3D-Zellhemisphärbild vu Cargo an ERES-Markéierer (C). Skala-Staang 1μm (A an B). D'Skala-Eenheet ass 0,551μm (C). Gas1-GFP gouf an diskreten ER-Regiounen oder Cluster detektéiert, während Mid2-iRFP detektéiert a verdeelt gouf duerch d'ER-Membran (C). (D) De Grafik weist déi relativ Fluoreszenzintensitéit vu Gas1-GFP a Mid2-iRFP am Gas1-GFP Cluster laanscht déi wäiss Pfeillinn (lénks). AU, arbiträr Eenheet. (E an F) representéieren dat 3D-Bild, dat d'Goods- an d'ERES-Mark kombinéiert. Gas1-GFP Cluster goufen an der Géigend vum spezifeschen ERES detektéiert. D'Skala-Eenheet ass 0,551 μm. (F) De wäisse feste Pfeil markéiert de Gas1-GFP Cluster, deen mam ERES assoziéiert ass. Déi mëttler a riets Panelen weisen dat zesummegefaasst vergréissert 3D-Bild an eng rotéiert Vue vum ausgewielte Gas1-GFP Cluster.
Déi enk raimlech Bezéiung tëscht dem Gas1-GFP Cluster an engem spezifeschen ERES weist drop hin, datt Gas1-GFP an e selektiven ERES erantrëtte kann, wat sech vun der Selektivitéit ënnerscheet, déi vum Mid2-iRFP benotzt gëtt, fir den ER ze verloossen. Fir dës Méiglechkeet ze adresséieren, hu mir den ERES-Verhältnis fir nëmmen eng oder zwou Wueren quantifizéiert (Figur 2, A bis C). Mir hunn festgestallt, datt déi meescht ERES (70%) nëmmen eng Zort Cargo enthalen. Déi ënnescht Bild vun der Figur 2C weist zwee typesch Beispiller vun ERES mat nëmmen Gas1-GFP (Figur 1) oder nëmmen Mid2-iRFP (Figur 2). Am Géigesaz dozou enthalen ongeféier 20% vum ERES zwou Cargoen, déi sech am selwechte Beräich iwwerlappen. Et gouf festgestallt, datt e puer ERES (10%) zwou Zorte vu Cargo enthalen, awer si goufen a kloer verschiddene Beräicher isoléiert. Dofir weist dës statistesch Analyse, datt nodeems den ER exportéiert gouf, GPI-AP Gas1-GFP an d'transmembran Cargo Mid2-iRFP a verschidden ERES opgedeelt sinn (Figur 2D). Dës Sortierungseffizienz entsprécht ganz der viregter biochemescher Analyse (6) a morphologescher Bestëmmung (7). Mir kënnen och d'Verhale vun der quarantänescher Ladung observéieren, déi an den ERES erakënnt (Figur 2E a Film S2). Figur 2E weist, datt nëmmen en klengen Deel vu Gas1-GFP (Panel 3) oder Mid2-iRFP (Panel 4) vun enger Säit an den ERES erakënnt an an engem diskreten Beräich agespaart ass. Panel 5 vun der Figur 2E weist, datt Gas1-GFP a Mid2-iRFP heiansdo am selwechten ERES fonnt ginn, awer si erakënnt vu verschiddene Säiten a sinn a separaten Regiounen konzentréiert, déi verschidde COPII-Vesikelen duerstelle kënnen. Mir hunn och bestätegt, datt déi observéiert Trennung a Klassifikatioun vu C26-Ceramid-baséiertem GPI-AP Gas1 als selektiven ERES spezifesch ass, well eng aner transmembran Sekretiounslaascht, dat GFP-markéiert Plasmamembranprotein Axl2 (27), e ähnlecht Verhale wéi Mid2-iRFP weist. (Bild S1 a Film S3). Dat nei synthetiséiert Axl2-GFP gëtt duerch d'ER-Membran verdeelt wéi Mid2-iRFP (Figur S1, A an B), a ass a ville ERESen zesumme mat Mid2-iRFP lokaliséiert (Figur S1, B bis D). D'Paneele 1 an 2 vun der Figur 1. S1C weisen zwee typesch Beispiller vun ERES, wou sech zwou transmembran Ladungen iwwerlappen. An dëse Fäll kommen déi zwou Wueren zesummen an den ERES eran (Figur S1E, Panel 3 a Film S3).
D'sec31-1 Zellen, déi Galaktose-induzéierbar Sekretiounen expriméieren, Gas1-GFP (GPI-AP, gréng) a Mid2-iRFP (TMP, blo) an déi konstitutiv ERES-Markéierung Sec13-mCherry (ERES, magenta), goufen bei 37 °C placéiert. Nodeems se 30 Minutten bei °C inkubéiert waren, gouf d'Temperatur op 24 °C bruecht fir de Sekretiounsblock fräizesetzen, an no 20 Minutten gouf eng Foto mat SCLIM gemaach. (A bis C) Representativ 2D-Projektiounsbiller (A; Skala-Balke, 1 μm) oder 3D-Zellhemisphärbiller (B an C; Skala-Eenheet, 0,456 μm) vun der Fracht an 10 z-Schnëtter, déi mat ERES markéiert sinn. Déi ënnescht Panel an (B) an de Panel an (C) weisen veraarbecht Biller fir nëmmen d'Wueren ze weisen, déi am ERES präsent sinn (magenta) [Gas1-GFP (gro) a Mid2-iRFP (hellblo)]. (C) Oppene Pfeil: ERES transportéiert nëmmen ee Stéck Fracht (1 bis 4). Groe Pfeil: ERES enthält getrennt Cargo (5). Wäissen, duerchdränge Pfeil: ERES enthält zesummegelaf Cargo. Ënnen: Den ausgewielten eenzegen ERES enthält nëmmen Gas1-GFP (1) oder Mid2-iRFP (2). Skala-Balke, 100 nm. (D) Quantifizéierung vun der Photomikrographie, déi an (C) beschriwwe gëtt. Den duerchschnëttleche Prozentsaz vun ERES, deen nëmmen eng Cargo (Gas1-GFP oder Mid2-iRFP), getrennt Cargo an iwwerlappend Cargo enthält. An dräi onofhängege Experimenter, n=432 an 54 Zellen. Feelerbalke = SD. Zweisäitegen, ongepaarten t-Test. *** P = 0,0002. (E) 3D-Bild vun ausgewielten ERES vu quarantänescher Cargo, markéiert mat (C). Gas1-GFP (gréng) (3) oder Mid2-iRFP (blo) (4) trëtt vun enger Säit an den ERES (magenta) an ass op e klenge Beräich am ERES beschränkt. Heiansdo trëtt béid Zorte vu Cargo vun der selwechter Säit an deeselwechten ERES (5) an ass op e isoléierte Beräich am ERES beschränkt. Skalabalke, 100 nm.
Duerno hu mir eng Hypothese getest, datt de laange Acylkette-Ceramid (C26), deen an der ER-Membran präsent ass, déi spezifesch Gruppéierung an Sortéierung vu Gas1 an selektiv ERES dréit. Zu dësem Zweck hu mir e modifizéierten Hefestamm GhLag1 benotzt, bei deem déi zwou endogen Ceramidsynthasen Lag1 a Lac1 duerch GhLag1 (den Lag1-Homolog vu Kotteng) ersat goufen, wat zu engem Hefestamm mat engem Zellmembran-Ceramidstamm féiert, deen méi kuerz ass wéi de Wildtyp (Figur 3A) (28). D'Massenspektrometrie (MS) Analyse huet gewisen, datt a Wildtyp-Stämm 95% vum gesamte Ceramid ganz laang (C26) Ketten-Ceramid ass, während a GhLag1 85% vum Ceramid ganz laang (C18 an C16) ass, nëmmen 2% vum Ceramid ganz laang (C26) Ketten-Ceramid ass. Obwuel C18- a C16-Ceramiden déi Haaptceramiden sinn, déi bis elo an der GhLag1-Membran nogewise goufen, huet d'MS-Analyse och bestätegt, datt den GPI-Anker vum Gas1-GFP, deen am GhLag1-Stamm expriméiert gëtt, C26-Ceramid enthält, wat vergläichbar mat Wildtyp-Lipiden ass. D'Qualitéit ass déiselwecht (Fig. 3A) (26). Dofir bedeit dat, datt den Ceramid-Remodeling-Enzym Cwh43 héich selektiv fir C26-Ceramid ass, wéi an der Figur 26 gewisen, awer et enthält bevorzugt den GPI-Anker aus enger klenger Quantitéit C26-Ceramid am GhLag1-Stamm. S2 (29). Trotzdem enthält d'Zellmembran vum GhLag1 am Fong nëmmen C18-C16-Ceramid, während Gas1-GFP nach ëmmer C26-Ceramid huet. Dëse Fakt mécht dëse Stamm zu engem idealen Instrument fir spezifesch d'Problem vun der Acylkettelängt vum Membranceramid am ER ze léisen. Déi hypothetesch Roll vu Klass an Sortéierung. Dann hu mir fir d'éischt d'Fäegkeet vu C26 Gas1-GFP ënnersicht, sech a Clusteren am GhLag1 mat engem temperaturempfindleche mutanten Allel vu sec31-1 duerch konventionell Fluoreszenzmikroskopie ze accumuléieren, wou nëmmen déi laang (C18-C16) Kette am ER-Membran Ceramid existéiert (Fig. 3). Mir hunn observéiert, datt am sec31-1 de gréissten Deel vum Gas1-GFP a Clusteren konzentréiert war, während Gas1-GFP am sec31-1 GhLag1 mat laanger (C18-C16) laanger Ceramid-ER-Membran haaptsächlech net geclustert a verdeelt war an der ganzer ER-Membran. Fir genee ze sinn, well d'C26-Ceramid-baséiert Clustering enk mat spezifeschem ERES verbonnen ass (Figur 1), hu mir als nächst ënnersicht, ob dëse Prozess och d'Funktioun vum ER-Exportproteinmechanismus betreffe kann. GPI-AP benotzt e spezielle COPII-System fir den ER-Export, deen aktiv duerch den strukturellen Ëmbau vum Glykan-Deel vum GPI-Anker vum Ted1 reguléiert gëtt (30, 31). De rekombinante GPI-Glykan gëtt dann vum transmembrane Cargo-Rezeptor-p24-Komplex erkannt, deen dann selektiv Lst1 rekrutéiert, wat eng spezifesch Isoform vun der Haapt-COPII-Cargo-Bindungs-Ënnereenheet Sec24 ass, wouduerch eng GPI-AP-räich COPII geformt gëtt. Vesikelen sinn néideg (31-33). Dofir hu mir en Duebelmutant konstruéiert, deen d'Deletioun vun dësen eenzele Proteinen (der p24-Komplexkomponent Emp24, dem GPI-Glykan-Remodeling-Enzym Ted1 an der spezifescher COPII-Ënnereenheet Lst1) mam sec31-1-Mutantstamm kombinéiert huet, an hunn se ënnersicht. Ob et méiglech ass, Gas1-Cluster-GFP ze bilden (Figur 3). Mir hunn observéiert, datt a sec31-1emp24Δ an sec31-1ted1Δ Gas1-GFP haaptsächlech ongeclustert ass a sech duerch d'ER-Membran verdeelt huet, wéi virdru bei sec31-1 GhLag1 gesinn, während a sec31-1lst1Δ Gas1-GFP ähnlech wéi sec31-1 ass. Dës Resultater weisen drop hin, datt nieft der Präsenz vu C26-Ceramid an der ER-Membran, d'Clustering vu Gas1-GFP och un de p24-Komplex muss bannen a keng spezifesch Lst1-Rekrutéierung erfuerdert. Duerno hu mir d'Méiglechkeet ënnersicht, datt d'Kettenlängt vu Ceramid an der ER-Membran d'Bindung vu Gas1-GFP un p24 reguléiere kann. Mir hunn awer festgestallt, datt d'Präsenz vu C18-C16-Ceramid an der Membran weder d'GPI-Glykanen beaflosst, déi vum p24-Komplex rekonstruéiert ginn (Figuren S3 an S4, A an B) nach d'Bindung un GPI-AP an d'Exportfäegkeet vu GPI-AP beaflossen. Rekrutéiert de COPII-Subtyp Lst1 (Figur S4C). Dofir erfuerdert d'C26-Ceramid-ofhängeg Clustering keng Proteininteraktioune mat verschiddenen ER-Exportproteinmechanismen, mä ënnerstëtzt en alternativen Sortéierungsmechanismus, deen duerch d'Lipidlängt ugedriwwe gëtt. Duerno hu mir analyséiert, ob d'Ceramid-Acyl-Kettenlängt an der ER-Membran wichteg ass fir déi effektiv Klassifikatioun vu Gas1-GFP als selektiv ERES. Well Gas1 am GhLag1-Stamm mat kuerzkettegen Ceramid den ER verléisst an an d'Plasmamembran kënnt (Figur S5), gleewen mir, datt wann d'Sortéierung duerch d'Längt vun der Ceramid-Acylkette bestëmmt gëtt, de Gas1 am GhLag1-Stamm ëmgeleet a gekräizt ka ginn. ERES-Wueren mat der selwechter Membran.
(A) D'Zellmembran vu GhLag1 enthält haaptsächlech méi kuerz C18-C16 Ceramiden, während den GPI-Anker vu Gas1-GFP nach ëmmer deeselwechten C26 IPC wéi Wildtyp-Zellen huet. Uewen: Acylkettenlängtanalyse vu Ceramid an der Zellmembran vu Wildtyp (Wt) a GhLag1p-Stämme duerch Massespektrometrie (MS). D'Donnéeë representéieren de Prozentsaz vum gesamten Ceramid. Den Duerchschnëtt vun dräi onofhängege Experimenter. Feelerbalke = SD. Zweisäitegen ongepaarten t-Test. **** P <0,0001. Ënnescht Panel: MS-Analyse vun der Acylkettenlängt vum IPC, deen am Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI-Anker präsent ass, expriméiert am Wildtyp- a GhLag1p-Stämme. D'Donnéeë representéieren de Prozentsaz vum gesamten IPC-Signal. Duerchschnëtt vu fënnef onofhängege Experimenter. Feelerbalke = SD. Zweisäitegen ongepaarten t-Test. ns, net wichteg. P = 0,9134. (B) Fluoreszenzmikroskopesch Opname vun sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ an sec31-1lst1Δ Zellen, déi Galaktose-induzéiert Gas1-GFP expriméieren, goufen 30 Minutten bei 37°C inkubéiert a weidergeleet un d'Fuerderung vun der Routinefluoreszenzmikroskopie no 24°C. Wäisse Pfeil: ER Gas1-GFP Cluster. Oppene Pfeil: Ongeclusterte Gas1-GFP ass op der ganzer ER-Membran verdeelt a weist d'charakteristesch ER-Kärringfärbung. Skala-Balk, 5μm. (C) Quantifizéierung vun der Photomikroskopesch Opnam, déi a (B) beschriwwe gëtt. Den duerchschnëttleche Prozentsaz vun Zellen mat punktéierter Gas1-GFP Struktur. An dräi onofhängege Experimenter, n≥300 Zellen. Feelerbalk = SD. Zweesäitegen ongepaarten t-Test. **** P <0,0001.
Fir dëst Problem direkt ze léisen, hu mir eng SCLIM-Visualiséierung vu Gas1-GFP a Mid2-iRFP a GhLag1 mam temperatursensitive mutanten Allel sec31-1 duerchgefouert (Figur 4 a Film S4). Nodeems den ER bei 37°C gehale gouf an duerno bei 24°C fräigesat gouf, war de gréissten Deel vum nei synthetiséierte Gas1-GFP net geclustert a verdeelt iwwer d'ER-Membran, wéi mat konventionelle Mikroskope observéiert gouf (Figur 4, A an B). Zousätzlech enthält e groussen Undeel vun ERES (67%) zwou Zorte vu Cargo, déi sech zesumme dran befannen (Figur 4D). D'Paneele 1 an 2 vun der Figur 4C weisen zwee typesch Beispiller vun ERES mat iwwerlappendem Gas1-GFP a Mid2-GFP. Zousätzlech goufen déi zwou Wueren an deeselwechten ERES rekrutéiert (Figur 4E, Panel 3 a Film S4). Dofir weisen eis Resultater drop hin, datt d'Längt vun der Ceramid-Acylkette an der ER-Membran e wichtegen Determinant vun der ER-Proteinaggregatioun a Klassifikatioun ass.
Sec31-1 GhLag1 Zellen, déi Galaktose-induzéiert Sekretiounen expriméieren, Gas1-GFP (GPI-AP, gréng) a Mid2-iRFP (TMP, blo) a konstitutiv ERES-markéiert Sec13-mCherry (ERES, magenta). Bei 37°C inkubéieren. 30 Minutte weidergoen, op 24°C senken fir Sekretiounen fräizesetzen, an no 20 Minutte mat SCLIM fotograféieren. (A bis C) Representativ 2D Projektiounsbiller (A; Skala-Balke, 1μm) oder 3D Zell-Helmkugelbiller (B an C; Skala-Eenheet, 0,45μm) vun den 10 z-Schnëtter, déi duerch Cargo an ERES markéiert sinn. Déi ënnescht Panel an (B) an de Panel an (C) weisen veraarbecht Biller fir nëmmen d'Gidder an ERES (magenta) ze weisen [Gas1-GFP (gro) a Mid2-iRFP (hellblo)]. (C) Wäiss gefëllte Pfeil: ERES, Gidder iwwerlappen sech. Oppene Pfeil: ERES enthält nëmmen een Element. Ënnescht Panel: Den ausgewielten ERES huet iwwerlappend Wueren (1 an 2) markéiert an (C). Skala-Balke, 100 nm. (D) Quantifizéierung vun der Photomikrographie beschriwwen an (C). An den sec31-1 an sec31-1 GhLag1 Eenheeten ass nëmmen eng Ladung (Gas1-GFP oder Mid2-iRFP) abegraff, an den duerchschnëttleche Prozentsaz vun ERES fir isoléiert Ladung an iwwerlappend Ladung. An dräi onofhängege Experimenter, n = 432 an 54 Zellen (sec31-1) an n = 430 an 47 Zellen (sec31-1 GhLag1). Fehlerbalke = SD. Zweesäitegen ongepaarten t-Test. *** P = 0,0002 (sec31-1) an ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D-Bild vum ausgewielten ERES mat iwwerlappender Ladung (3) markéiert an (C). Gas1-GFP (gréng) a Mid2-iRFP (blo) kommen op ERES (magenta) vun der selwechter Säit zou a bleiwen am selwechten ERES-Sperrberäich. Skala-Balke, 100 nm.
Dës Studie liwwert direkt in vivo Beweiser dofir, datt Lipid-baséiert Proteinladungen a selektiv Exportplazen am Sekretiounswee klasséiert ginn, an weist d'Wichtegkeet vun der Acylkettelängt fir d'Selektivitéit vun der Klassifikatioun op. Mat enger leistungsstarker a modernster Mikroskopietechnik mam Numm SCLIM hu mir dat nei synthetiséiert Gas1-GFP (e wichtege Plasmamembran-GPI-AP mat engem ganz laangen Acylkette (C26) Ceramid-Lipiddeel) an Hef demonstréiert. D'Regiounen, déi an diskreten ERe geclustert sinn, si mat spezifeschem ERES assoziéiert, während transmembran sekretéiert Proteinen duerch d'ER-Membran verdeelt sinn (Figur 1). Zousätzlech ginn dës zwou Zorte vu Wueren selektiv an ënnerschiddlech ERES eran (Figur 2). D'Acylkettelängt vum zelluläre Ceramid an der Membran gëtt vu C26 op C18-C16 reduzéiert, de Gas1-GFP-Cluster gëtt an déi diskret ER-Regioun ënnerbrach, a Gas1-GFP gëtt ëmgeleet fir den ER mam Transmembranprotein duerch deeselwechten ERES ze verloossen (Figur 3 a Figur 3).4).
Obwuel GPI-AP e spezialiséierte Proteinmechanismus benotzt fir den ER ze verloossen, hu mir festgestallt, datt d'C26-Ceramid-ofhängeg Trennung net op differenziellen Proteininteraktiounen baséiert, déi zu enger ERES-Spezialisatioun féiere kënnen (Figuren S4 an S5). Amplaz ënnerstëtzen eis Erkenntnisser en alternativen Klassifikatiounsmechanismus, deen duerch Lipid-baséiert Proteinclustering an de spéideren Ausschluss vun anere Ladungen ugedriwwe gëtt. Eis Observatioune weisen drop hin, datt d'Gas1-GFP Regioun oder Cluster, déi mat engem spezifeschen ERES assoziéiert sinn, dat transmembran sekretéiert Protein Mid2-iRFP feelt, wat drop hiweist, datt de C26-Ceramid-ofhängege GPI-AP Cluster hiren Entrée an den jeweilegen ERES erliichtert an zur selwechter Zäit transmembran ausschléisst. D'Sekretiounen trëtt an dësen spezifeschen ERES an (Figuren 1 an 2). Am Géigesaz dozou verursaacht d'Präsenz vu C18-C16 Ceramiden an der ER-Membran net, datt GPI-AP Regiounen oder Cluster bildt, sou datt se keng transmembran sekretéiert Proteinen an deeselwechten ERES ausschléissen oder ersetzen (Figuren 3 an 4). Dofir proposéiere mir, datt C26-Ceramid d'Trennung a Klassifikatioun dréit, andeems et d'Clustering vu Proteinen, déi mat spezifeschen ERES verbonne sinn, erliichtert.
Wéi kann een dës C26-Ceramid-ofhängeg Gruppéierung an engem spezifesche ER-Beräich erreechen? D'Tendenz vum Membran-Ceramid, sech lateral ze trennen, kann dozou féieren, datt GPI-AP a C26-Ceramid kleng an direkt geuerdnet Lipiden an der méi onregelméisseger Lipidëmfeld vun der ER-Membran bilden, déi méi kuerz an onsaturéiert Glycerolipiden enthalen. Qualitéitscluster (17, 18). Dës kleng temporär Cluster kënnen no der Bindung un de p24-Komplex weider a méi grouss, méi stabil Cluster fusionéiert ginn (34). Am Aklang domat hu mir gewisen, datt C26 Gas1-GFP mam p24-Komplex interagéiere muss, fir méi grouss siichtbar Cluster ze bilden (Figur 3). De p24-Komplex ass en heterozygot Oligomer, deen aus véier verschiddene p24-Transmembranproteinen an Hef besteet (35), wat eng multivalent Bindung bitt, déi zu enger Vernetzung vu klenge GPI-AP-Cluster féiere kann, wouduerch méi grouss stabil Cluster entstinn (34). D'Interaktioun tëscht de Protein-Ektodomänen vun de GPI-APs kéint och zu hirer Aggregatioun bäidroen, wéi et während hirem Golgi-Transport a polariséierten Epithelzellen vu Säugetieren gewisen gouf (36). Wann awer C18-C16 Ceramid an der ER-Membran präsent ass, ginn keng grouss separat Cluster geformt, wann de p24-Komplex un de Gas1-GFP bindt. De Mechanismus, deen dozou bäidréit, kéint vun de spezifesche physikaleschen a chemeschen Eegeschafte vum laangen Acylkette-Ceramid ofhänken. Biophysikalesch Studien iwwer kënschtlech Membranen weisen, datt, obwuel souwuel laang (C24) wéi och kuerz (C18-C16) Acylkette-Ceramiden d'Phasentrennung verursaache kënnen, nëmme laang Acylkette-Ceramiden (C24) eng héich Krümmung a Filmbéiung förderen kënnen, fir de Film nei ze formen. Duerch géigesäiteg Referenz (17, 37, 38). Et gouf gewisen, datt d'Transmembranhelix vun TMED2, dem mënschlechen Homolog vun Emp24, selektiv mat C18 Ceramid-baséiertem Sphingomyelin an de zytoplasmatesche Lobulen interagéiert (39). Mat Hëllef vu molekulare Dynamik (MD) Simulatiounen hu mir festgestallt, datt souwuel C18 wéi och C26 Ceramiden sech ronderëm déi zytoplasmatesch Lobulen vun der Emp24 Transmembranhelix accumuléieren, an si hunn ähnlech Virléiften (Figur S6). Et ass derwäert ze bemierken, datt dëst drop hiweist, datt d'Transmembranhelix vun Emp24 zu enger asymmetrescher Verdeelung vu Lipiden an der Membran féiere kann. Dëst ass e rezent Resultat baséiert op Mamendéierzellen. Ähnlech MD Simulatiounen weisen och d'Präsenz vun Etherlipiden (40). Dofir spekuléiere mir, datt C26 Ceramid an den zwou Lobulen vum ER26 lokal angereichert ass. Wann GPI-AP an de luminalen Lobulen direkt un de multivalente p24 bindt an d'Akkumulatioun vu C26-Ceramid ronderëm p24 an de zytoplasmatesche Lobulen, kann et déi begleedend Proteinaggregatioun an d'Membrankrümmung duerch d'Fanger förderen (41), wouduerch GPI-AP sech a separat Regiounen nieft dem ERES trennt, wat och déi staark gekrëmmt Regiounen vun der ER-Membran favoriséiert (42). Fréier Berichter hunn de proposéierte Mechanismus ënnerstëtzt (43, 44). Déi multivalent Bindung vun Oligolectinen, Pathogenen oder Antikörper un Ceramid-baséiert Glykosphingolipiden (GSL) op der Plasmamembran ausléist eng grouss GSL-Aggregatioun, verbessert d'Phasentrennung a verursaacht Membrandeformatioun an Internaliséierung (44). Iwabuchi etc. (43) Et gouf festgestallt, datt a Präsenz vu laangen (C24) awer net kuerzen (C16) Acylketten, de multivalente Ligand, deen un GSL-Laktosylceramid gebonnen ass, d'Bildung vu grousse Clusteren an Membraninvaginatioun induzéiert huet, an d'Zytoplasma-Lyn-vermittelte Signaltransduktioun op de Fligelen duerch Acylketten a gekoppelten Neutrophilen interdigitéiert gëtt.
A polariséierten Epithelzellen bei Säugetieren kontrolléiert d'Konzentratioun vum Anti-Golgi-Netzwierk (TGN) bis op d'Niveau vun der apikaler Plasmamembran d'Trennung an d'Sortéierung vu GPI-AP (10, 45). Dës Aggregatioun gëtt duerch d'GPI-AP-Oligomeriséierung ugedriwwen (36), awer si kann och vun der Ceramidkettelängt ofhänken, déi mir an Hef fannen. Och wann de Säugetier-GPI-AP en Anker op Basis vun Etherlipiden huet, a seng chemesch Struktur ganz anescht ass wéi déi vum ganz laangen Acylkette-Ceramid, huet eng rezent Studie festgestallt, datt béid Lipiden evolutiv ähnlech physikalesch a chemesch Eegeschaften a Funktiounen hunn (40). Dofir kann den Etherlipiddeel a Säugetierzellen dem C26-Ceramid an Hef ähnlech sinn, a seng Roll ass et, sech mam laangkettege Ceramid an der Membran ze assoziéieren, fir d'GPI-AP-Aggregatioun an d'Sortéierung ze förderen. Och wann dës Méiglechkeet nach direkt getest muss ginn, ënnerstëtzen fréier Erkenntnisser, datt den Transport vum laangkettege Ceramid an de Golgi-Kierper net duerch zytoplasmatesch Transferproteine ​​​​duerchgefouert gëtt, mä vun der Synthese vu GPI-Anker wéi an Hef ofhänkt. Dofir schéngt den evolutiv konservative Mechanismus fäeg ze sinn, ganz laang Acylkette-Ceramid a GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) selektiv an der selwechter Transportvesikel ze kotransportéieren.
A polariséierten Epithelzellsystemer vu Mamendéieren a vu Säugetieren trëtt d'GPI-AP-Aggregatioun an d'Trennung vun anere Plasmamembranproteinen op, ier se d'Zelluewerfläch erreechen. Paladino et al. (48) hunn erausfonnt, datt um TGN vu polariséierten Epithelzellen vu Mamendéieren d'GPI-AP-Clustering net nëmme fir déi selektiv Klassifikatioun vu GPI-APs op déi apikal Plasmamembran néideg ass, mä och d'Clusteringorganisatioun vu GPI-APs an hir biologesch Aktivitéit reguléiert. Zelluewerfläch. Bei Hef huet dës Studie gewisen, datt de C26-Ceramid-ofhängegen GPI-AP-Cluster um ER d'Clusterorganisatioun an déi funktionell Aktivitéit vu GPI-AP op der Plasmamembran reguléiere kann (24, 49). Am Aklang mat dësem Modell sinn GhLag1-Zellen allergesch géint GPI-Inhibitoren oder Medikamenter, déi d'Integritéit vun der Zellwand beaflossen (28), an de Besoin fir funktionell Gas1-GFP-Cluster (49) vum Tipp-Ceramid, deen an der Paarung vun Hefezellen projetéiert gëtt, weist op méiglech physiologesch Konsequenze vun hLag1-Zellen hin. GPI-AP-Feeler. Weider Tester, ob déi funktionell Organisatioun vun der Zelluewerfläch vum ER aus duerch eng Sortéierungsmethod baséiert op der Lipidlängt programméiert gouf, wäerten awer den Objet vun eiser zukünfteger Fuerschung sinn.
D'Saccharomyces cerevisiae-Stämm, déi an dëser Aarbecht benotzt goufen, sinn an der Tabell S1 opgezielt. D'MMY1583- an MMY1635-Stämm vun SCLIM fir d'Bildgebung vu Live-Zellen goufen am Hannergrond vum W303 konstruéiert. Dës Stämm, déi Sec13-mCherry mat engem fluoreszenten Protein-Tag expriméieren, goufen mat enger Polymerasekettenreaktioun (PCR)-baséierter Method mat pFA6a-Plasmid als Schabloun konstruéiert (23). De Stamm, deen Mid2-iRFP expriméiert, deen ënner der Kontroll vum GAL1-Promoter mat fluoreszentem Protein markéiert ass, gouf wéi follegt konstruéiert. PCR-Amplifikatioun vun der iRFP-KanMx-Sequenz vum pKTiRFP-KAN Vektor (Kaddo vum E. O'Shea, Addgene Plasmid Nummer 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; Research Resource Identifier (RRID): Addgene_64687) an an den C-Terminus vum endogene Mid2 agefouert. Nodeems d'Mid2-iRFP-Genomsequenz amplifizéiert a an de GAL1-Promotor geklont gouf, gouf se an d'Not I-Sac I-Plaz vum Integratiounsplasmid pRS306 integréiert. De resultéierende Plasmid pRGS7 gouf mat Pst I lineariséiert fir an den URA3-Locus z'integréieren.
De Gas1-GFP-Fusiounsgen gëtt ënner der Kontroll vum GAL1-Promoter am Zentromer (CEN)-Plasmid expriméiert, deen wéi follegt konstruéiert ass. D'Gas1-GFP-Sequenz gouf duerch PCR vum pRS416-GAS1-GFP-Plasmid (24) (Kaddo vum L. Popolo) amplifizéiert a geklont an d'Xma I-Xho I-Plasmid vum CEN-Plasmid pBEVY-GL LEU2 (Kaddo vum C). Miller; Addgene-Plasmidnummer 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). De resultéierende Plasmid gouf pRGS6 genannt. Den Axl2-GFP-Fusiounsgen gëtt och ënner der Kontroll vum GAL1-Promoter vum pBEVY-GL LEU2-Vektor expriméiert, a seng Konstruktioun ass wéi follegt. D'Axl2-GFP-Sequenz gouf vum pRS304-p2HSE-Axl2-GFP-Plasmid (23) duerch PCR amplifizéiert a geklont an de BamHI-PstI-Plaz vum pBEVY-GL LEU2-Vektor. De resultéierende Plasmid gouf pRGS12 genannt. D'Sequenz vun den Oligonukleotiden, déi an dëser Studie benotzt goufen, ass an der Tabell S2 opgezielt.
De Stamm gouf mat 0,2% Adenin an 2% Glukos [YP-Dextrose (YPD)], 2% Raffinose [YP-Raffinose]-räichem Hefextraktprotein p (YP)-Medium (1% Hefextrakt an 2% Protein ept. (YPR)] oder 2% Galaktose [YP-Galaktose (YPG)] als Kuelestoffquell oder an engem synthetesche Minimalmedium (0,15% Hefstickstoffbasis an 0,5% Ammoniumsulfat) ergänzt, fir déi entspriechend Aminosaieren a Basen, déi fir d'Ernierung gebraucht ginn, ze ergänzen, an deen 2% Glukos (synthetescht Glukosminimalmedium) oder 2% Galaktose (synthetescht Galaktoseminimalmedium) als Kuelestoffquell enthält.
Fir Echtzäit-Bildgebung goufen temperaturempfindlech sec31-1-Mutantzellen, déi de Konstrukt ënner dem GAL1-Promoter expriméieren, an YPR-Medium bei 24°C iwwer Nuecht bis an d'Mëtt vun der Logarithmusphase gewuess. No der Induktioun an YPG bei 24°C fir 1 Stonn goufen d'Zellen 30 Minutten an SG bei 37°C inkubéiert an duerno op 24°C transferéiert fir se vum Sekretiounsblock fräizesetzen. Concanavalin A gouf benotzt fir d'Zellen op engem Glasträger ze fixéieren an duerch SCLIM ofgebild ze ginn. SCLIM ass eng Kombinatioun aus dem Olympus IX-71 invertéierte Fluoreszenzmikroskop an enger UPlanSApo 100×1.4 numerescher Apertur Ueleglëns (Olympus), engem High-Speed- a Signal-zu-Rausch-Verhältnis rotéierende Scheiwen-Konfokalscanner (Yokogawa Electric), engem personaliséierte Spektrometer an enger personaliséierter Ofkillung. De Bildverstärker vum System (Hamamatsu Photonics) kann e Lupp-Lënsen-System mat enger definitiver Vergréisserung vun ×266.7 an enger Ladungsgekoppelter Apparatkamera ubidden, déi Elektronen multiplizéiert (Hamamatsu Photonics) (21). D'Bilderfassung gëtt mat enger personaliséierter Software (Yokogawa Electric) duerchgefouert. Fir 3D-Biller hu mir en personaliséierten piezoelektreschen Aktuator benotzt fir d'Objektivlëns vertikal ze vibréieren, an déi optesch Deeler 100 nm vuneneen an engem Stack gesammelt. D'Z-Stack-Bild gëtt an 3D-Voxeldaten ëmgewandelt, an déi theoretesch Punktverbreedungsfunktioun, déi fir de rotéierende Scheiwen-Konfokalmikroskop benotzt gëtt, gëtt fir d'Dekonvolutiounsveraarbechtung mat der Volocity-Software (PerkinElmer) benotzt. Mat Hëllef vun der Volocity Software fir automatesch d'Schwellwäerter fir d'Co-Lokatiounsanalyse ze bestëmmen, gouf den ERES inklusiv Fracht gemooss. D'Line Scan Analyse gouf mat der MetaMorph Software (Molecular Devices) duerchgefouert.
Benotzt d'GraphPad Prism Software fir d'statistesch Signifikanz ze bestëmmen. Fir den zweesäitege Student's t-Test an den ordinären One-Way-Varianzanalyse (ANOVA) Test ginn d'Ënnerscheeder tëscht de Gruppen als bedeitend Auswierkungen op P < 0,05 ugesinn (*).
Fir d'Fluoreszenzmikroskopie vu Gas1-GFP goufen d'Log-Phase-Zellen iwwer Nuecht an YPD gewuess a mat Zentrifugatioun gesammelt, zweemol mat Phosphat-gepufferter Salzléisung gewäsch an op d'mannst 15 Minutten op Äis inkubéiert, an duerno ënner dem Mikroskop weidergefouert wéi virdru beschriwwen a Kontroll (24). De Leica DMi8 Mikroskop (HCX PL APO 1003/1.40 Ueleg PH3 CS) mat enger Objektivlëns, engem L5 (GFP) Filter, enger Hamamatsu Kamera an enger Application Suite X (LAS X) Software gouf fir d'Acquisitioun benotzt.
D'Prouwen goufen 10 Minutte laang mat SDS-Proufpuffer bei 65°C denaturéiert an duerno duerch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) getrennt. Fir d'Immunoblotting-Analyse goufen 10 μl Prouf pro Spur gelueden. Primären Antikörper: Benotzt polyklonalt Kanéngchen-Anti-Gas1 an enger Verdënnung vun 1:3000, polyklonalt Kanéngchen-Anti-Emp24 an enger Verdënnung vun 1:500, a polyklonalt Kanéngchen-Anti-GFP (e Kaddo vum H. Riezman) an enger Verdënnung vun 1:3000. De monoklonalen Maus-Anti-Pgk1-Antikörper gouf an enger Verdënnung vun 1:5000 benotzt (e Kaddo vum J. de la Cruz). Sekundären Antikörper: Mierrettichperoxidase (HRP)-konjugéiert Geesse-Anti-Kanéngchen-Immunoglobulin G (IgG) an enger Verdënnung vun 1:3000 (Pierce). HRP-konjugéiert Geess-Anti-Maus-IgG gouf an enger Verdënnung vun 1:3000 (Pierce) benotzt. D'Immunantwortzon gouf mat der Chemilumineszenzmethod vum SuperSignal West Pico Reagens (Thermo Fisher Scientific) observéiert.
Wéi an (31) beschriwwen, gouf en natierlecht Immunoprezipitatiounsexperiment op der angereicherter ER-Fraktioun duerchgefouert. Kuerz gesot, d'Hefezellen goufen zweemol mat TNE-Puffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid a Proteaseinhibitor-Mëschung) bei 600 nm (OD600) bei enger optescher Dicht vun 100 gewäsch. Et gouf mat Glasperlen gebrach, an duerno goufen d'Zellreschter an d'Glasperlen duerch Zentrifugatioun ewechgeholl. Den Iwwerstand gouf dann bei 17.000 g fir 15 Minutten bei 4°C zentrifugéiert. De Pellet gouf an TNE resuspendéiert an Digitalis-Saponin gouf bis zu enger Endkonzentratioun vun 1% bäigefüügt. D'Suspension gouf 1 Stonn mat Rotatioun bei 4°C inkubéiert, an duerno goufen déi onléislech Komponenten duerch Zentrifugatioun bei 13.000 g bei 4°C fir 60 Minutten ewechgeholl. Fir d'Gas1-GFP Immunoprezipitatioun gëtt d'Prouf als éischt mat eidele Agaroseperlen (ChromoTek) bei 4°C fir 1 Stonn virinkubéiert, an dann mat GFP-Trap_A (ChromoTek) bei 4°C fir 3 Stonnen inkubéiert. Déi immunoprezipitéiert Perlen goufen fënnefmol mat TNE mat 0,2% Digoxigenin gewäsch, mat SDS-Proufpuffer eluéiert, op SDS-PAGE getrennt an duerch Immunoblotting analyséiert.
Wéi an (31) beschriwwen, gouf d'Vernetzungsbestëmmung op der angereicherter ER-Fraktioun duerchgefouert. Kuerz gesot, gouf déi angereicherter ER-Fraktioun mat 0,5 mM Dithiobis(succinimidylpropionat) inkubéiert (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). D'Vernetzungsreaktioun gouf duerch d'Zousätz vu Glycin (50 mM Endkonzentratioun, 5 Minutten, 20°C) ofgestoppt.
Wéi virdru beschriwwen (50), gouf eng MS-Analyse vu Ceramid a Wildtyp- a GhLag1-Stämme duerchgefouert. Kuerz gesot, goufen d'Zellen an der exponentieller Phas (3 bis 4 OD600 Eenheeten/ml) an YPD bei 30°C gewuess, an 25×107 Zellen goufen geernt. Hire Metabolismus gëtt mat Trichloressigsäure ofgekillt. Benotzt Extraktiounsléisungsmëttel [Ethanol, Waasser, Ether, Pyridin a 4,2 N Ammoniumhydroxid (15:15:5:1:0,018 v/v)] an 1,2 nmol intern Standard C17 Ceramid (860517, Avanti polar Lipid) Qualitéit). Benotzt Monomethylaminreagens [Methanol, Waasser, n-Butanol a Methylaminléisung (4:3:1:5 v/v)] fir eng mëll alkalesch Hydrolyse vum Extrakt duerchzeféieren, an dann benotzt waassergesättigt n-Butanol fir ze entsalzen. Schlussendlech gouf den Extrakt an engem Léisungsmëttel am positive Modus [Chloroform/Methanol/Waasser (2:7:1) + 5 mM Ammoniumacetat] resuspendéiert an an de Massenspektrometer injizéiert. Multi-Reaktiounsmonitoring (MRM) gouf fir d'Identifikatioun a Quantifizéierung vu Sphingolipidmoleküle duerchgefouert. Den TSQ Vantage Tertiär-Quadrupol-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) ass mat enger roboteriséierter Nanoflow-Ionenquell Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) fir d'Lipidanalyse ausgestatt. D'Kollisiounsenergie gëtt fir all Ceramidkategorie optimiséiert. MS-Donnéeë goufen am positive Modus kritt. Fir all biologescht Widdersproch ass de Lipidsignal de Median vun dräi onofhängege Miessungen.
Wéi an (31) beschriwwen, goufen d'Zellen (800×107), déi Gas1-GFP expriméiert hunn, enger natierlecher Immunoprezipitatioun ënnerworf. De gereinegte Gas1-GFP gouf duerch SDS-PAGE getrennt an op eng Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran transferéiert. D'Protein gouf visualiséiert andeems PVDF mat Amidschwaarz gefierft gouf. D'Gas1-GFP Band gouf vum PVDF ofgeschnidden a 5 Mol mat Methanol an eemol mat Waasser vu Flëssegkeetschromatographie-MS (LC-MS) Qualitéit gewäsch. Duerch Inkubatioun vum Membranstreifen mat 500μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), Puffer an 500μl frësch opgeléister 1 M Natriumnitritmëschung bei 37°C fir 3 Stonnen, gëtt d'Lipidfraktioun aus Gas1-GFP fräigesat a lyséiert. Fräisetzung vun Inosinphosphatceramid tëscht Glucosamin an Inositol (51). Duerno gouf de Membranstreifen véier Mol mat Waasser vu LC-MS Qualitéit gewäsch, bei Raumtemperatur gedréchent an an enger Stéckstoffatmosphär bei -80°C bis zur Analyse gelagert. Als Kontroll gouf fir all Experiment eng blann Prouf vun der PVDF-Membran benotzt. De Lipid, deen aus Gas1-GFP extrahéiert gouf, gouf dann duerch MS analyséiert wéi beschriwwen (50). Kuerz gesot, PVDF-Sträifen, déi GPI-Lipid enthalen, goufen an 75μl negativen Schimmelléisungsmëttel [Chloroform/Methanol (1:2) + 5 mM Ammoniumacetat] resuspendéiert an der Elektrospray-Ioniséierungsanalyse (ESI)-MRM/MS vun de Sphingolipid-Spezies (TSQ Vantage) passéiert. An dësem Fall goufen d'MS-Donnéeën am negativen Ionenmodus kritt.
Wéi virdru scho gesot, gouf den Lipiddeel vum GPI-Anker vum [3H]-Inositol-markéierten GPI-AP (16) getrennt. D'Lipiden goufen duerch Dënnschichtchromatographie mat engem Léisungsmëttelsystem (55:45:10 Chloroform-Methanol-0,25% KCl) getrennt a mat FLA-7000 (Fujifilm) visualiséiert.
D'Zellen, déi Gas1-GFP (600×107) expriméieren, goufen zweemol mat TNE-Puffer gewäsch, mat Glasperlen zerbrach an duerno zentrifugéiert fir Zellreschter a Glasperlen ze entfernen. Den Iwwerstand gouf dann 1 Stonn bei 4°C bei 17.000 g zentrifugéiert. De Pellet gouf an TNE gewäsch an 1 Stonn bei 37°C mat 1 U PI-PLC (Invitrogen) an TNE mat 0,2% Digitalis-Saponin inkubéiert. Nom Enzymbehandlung gouf d'Membran duerch Zentrifugatioun bei 17.000 g bei 4°C fir 1 Stonn ewechgeholl. Fir Gas1-GFP ze immunoprezipitéieren, gouf den Iwwerstand iwwer Nuecht mat GFP-Trap_A (ChromoTek) bei 4°C inkubéiert. De gereinegten Gas1-GFP, deen duerch SDS-PAGE getrennt gouf, gouf mat Coomassie Brilliant Blue gefierft. D'Gas1-GFP-Färbungsband gouf vum Gro ronderëm den Aquedukt ofgeschnidden, an no der Alkyléierung mat Iodacetamid a Reduktioun mat Dithiothreitol gouf eng In-Gel-Verdauung mat Trypsin duerchgefouert. Tryptesch Peptiden a Peptide mat GPI-Glykanen extrahéieren an dréchnen. Dat gedréchent Peptid gouf an 20 μl Waasser opgeléist. Eng Portioun (8μl) an den LC injizéiert. Eng Octadecylsilan (ODS)-Sail (Develosil 300ODS-HG-5; bannenzegen Duerchmiesser 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Aichi Präfektur, Japan) gouf benotzt fir Peptiden ënner spezifesche Gradientbedingungen ze trennen. Déi mobil Phas ass de Léisungsmëttel A (0,08% Ameensäure) an de Léisungsmëttel B (0,15% Ameensäure an 80% Acetonitril). En Accela HPLC-System (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) gouf benotzt fir d'Kolonn mat Léisungsmëttel A bannent 55 Minutten mat enger Duerchflussquote vu 50 μl min-1 fir 5 Minutten ze eluéieren, an duerno gouf d'Konzentratioun vum Léisungsmëttel B op 40% erhéicht. (Vereenegt Staaten). Den Eluat gouf kontinuéierlech an d'ESI-Ionenquell agefouert, an d'tryptesch Peptiden a Peptiden mat GPI-Glykanen goufen duerch LTQ Orbitrap XL (Hybrid linear Ionenfalle-Orbitrap-Massenspektrometer; Thermo Fisher Scientific) analyséiert. Am MS-Setup gouf d'Spannung vun der Kapillarquell op 4,5 kV agestallt, an d'Temperatur vum Transferkapillar gouf op 300°C gehalen. D'Kapillarspannung an d'Röhrlënsspannung goufen op 15 V respektiv 50 V agestallt. MS-Donnéeë goufen am positiven Ionenmodus (Opléisung vu 60.000; Massegenauegkeet vun 10 Deeler pro Millioun) an engem Masseberäich vun 300/m/z Mass/Ladungsverhältnis (m/z) 3000 kritt. D'MS/MS-Donnéeë ginn iwwer d'Ionenfalle am LTQ Orbitrap XL kritt [déi éischt 3 Zifferen, vun deenen d'Donnéeën ofhänken, Kollisiounsinduzéiert Dissoziatioun (CID)].
MD-Simulatioune goufe mat der GROMACS (52) Software an dem MARTINI 2 Kraaftfeld (53-55) duerchgefouert. De CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) gouf duerno benotzt fir eng Duebelschicht ze konstruéieren, déi Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) a Cer C18 oder DOPC a Cer C26 enthält. D'Topologie an d'Koordinaten vum Cer C26 ginn aus DXCE ofgeleet andeems déi extra Perlen aus dem Sphingosin-Schwanz ewechgeholl ginn. Benotzt de Prozess deen hei ënnendrënner beschriwwe gëtt fir d'Duebelschicht auszebalancéieren a lafe se aus, benotzt dann déi lescht Koordinaten vum System fir e System ze bauen, dat Emp24 enthält. Den Transmembrandomän vun der Hef Emp24 (Reschter 173 bis 193) gouf als α-Helix mat dem visuelle MD (VMD) Tool Molekularstruktur (58) konstruéiert. Duerno, nodeems déi iwwerlappend Lipiden ewechgeholl goufen, gouf d'Protein grob granuléiert an an d'Duebelschicht mat CHARMM GUI agebaut. Dat lescht System enthält 1202 DOPC an 302 Cer C26 oder 1197 DOPC an 295 Cer C18 an Emp24. Ioniséiert de System op eng Konzentratioun vun 0,150 M. Véier onofhängeg Widderhuelunge goufe fir zwou Duebelschicht-Kompositioune gemaach.
D'Lipid-Doppelschicht gëtt mam CHARMM GUI-Prozess ausgeglach, deen d'Minimiséierung an duerno d'Ausbalancéiere vu 405.000 Schrëtt enthält, woubei d'Positiounsbeschränkungen no an no reduzéiert an eliminéiert ginn, an den Zäitschratt vun 0,005 ps op 0,02 ps erhéicht gëtt. Nom Gläichgewiicht produzéiert et 6 µs mat engem Zäitschratt vun 0,02 ps. Nodeems Emp24 agefouert gouf, benotzt dee selwechte CHARMM GUI-Prozess fir de System ze minimiséieren an auszebalancéieren, an da leeft et fir 8 Sekonnen a Produktioun.
Fir all Systemer gëtt den Drock während dem Ausbalancéierungsprozess vum Berendsen-Barostat (59) kontrolléiert, a während dem Produktiounsprozess vum Parrinello-Rahman-Barostat (60). An alle Fäll ass den Duerchschnëttsdrock 1 bar an et gëtt e semi-isotropescht Drockkopplungsschema benotzt. Am Ausbalancéierungs- a Produktiounsprozess gëtt en Thermostat (61) mat Geschwindegkeetsrekalibrierung benotzt fir d'Temperatur vu Protein-, Lipid- a Léisungsmëttelpartikelen ze koppelen. Wärend dem ganze Betrib ass d'Ziltemperatur 310 K. Déi net-bindend Interaktioun gëtt berechent andeems eng Paarungslëscht mat dem Verlet-Schema mat enger Puffertoleranz vun 0,005 generéiert gëtt. Den Coulomb-Term gëtt mat Hëllef vum Reaktiounsfeld an enger Ofgrenzungsdistanz vun 1,1 nm berechent. Den Vander-Waals-Term benotzt e Ofgrenzungsschema mat enger Ofgrenzungsdistanz vun 1,1 nm, an de Verlet-Ofgrenzungsschema gëtt fir potenziell Drift benotzt (62).
Mat Hëllef vu VMD ass d'Grenzwellenlängt tëscht DOPC-Phosphatperlen oder Ceramid-AM1-Perlen an dem Protein 0,7 nm, an d'Zuel vun de Lipiden, déi mam Protein interagéieren, gëtt berechent. No der folgender Formel gëtt de Verarmungs-Beräicherungsfaktor (DE) wéi an (63) berechent: DE-Faktor = (d'Quantitéit vun den Gesamtlipiden am Protein 0,7) am Protein 0,7 (d'Quantitéit vu Cer an den Gesamtlipiden)
De gemellten Wäert gëtt als Duerchschnëtt kritt, an d'Fehlerbalke si véier onofhängeg Kopie vun SE. Déi statistesch Signifikanz vum DE-Faktor gëtt mam t-Test [(duerchschnëttlechDE-Faktor-1)/SE berechent. Berechent de P-Wäert aus der eensäiteger Verdeelung.
Den GROMACS-Tool gouf benotzt fir d'2D-lateral Dichtkaart vum System ze berechnen, deen Emp24 an de leschten 250 ns vum Verlaf enthält. Fir d'Anreicherungs-/Ofbaukaart vu Ceramid ze kréien, gëtt d'Dichtkaart vu Cer duerch d'Zomm vun der Kaart vu Cer an DOPC gedeelt, an dann duerch d'Konzentratioun vu Cer am Kierper. Déiselwecht Faarfkaarteskala gëtt benotzt.
Fir zousätzlech Materialien zu dësem Artikel, kuckt w.e.g. http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Dëst ass en Open-Access-Artikel, deen ënner de Bedéngunge vun der Creative Commons Attribution-Non-Commercial Lizenz verdeelt gëtt, déi d'Benotzung, d'Verdeelung an d'Reproduktioun an all Medium erlaabt, soulaang déi lescht Notzung net fir kommerzielle Gewënn ass an d'Viraussetzung ass, datt d'Originalwierk korrekt ass. Referenz.
Bemierkung: Mir froen Iech nëmmen Är E-Mailadress unzeginn, fir datt déi Persoun, déi Dir op der Säit recommandéiert, weess, datt Dir wëllt, datt si d'E-Mail gesäit an datt et kee Spam ass. Mir wäerten keng E-Mailadressen ophuelen.
Dës Fro gëtt benotzt fir ze testen ob Dir e Besucher sidd an automatesch Spam-Sendung ze verhënneren.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez-Linero, Wagho Sergio-Linero, Wagho (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-Echtzäit-Bildgebung mat héijer Opléisung weist d'Wichtegkeet vun der Ceramidkettenlängt fir d'Proteinsortéierung a selektiven Ausgabeplazen.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez-Linero, Wagho Sergio-Linero, Wagho (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-Echtzäit-Bildgebung mat héijer Opléisung weist d'Wichtegkeet vun der Ceramidkettenlängt fir d'Proteinsortéierung a selektiven Ausgabeplazen.
©2020 American Association for the Advancement of Science. all Rechter reservéiert. AAAS ass e Partner vun HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.