Merci fir Äre Besuch op Nature.com. D'Browserversioun, déi Dir benotzt, ënnerstëtzt CSS limitéiert. Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech, en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten). An der Zwëschenzäit, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, wäerte mir d'Websäit ouni Stiler a JavaScript uweisen.
Am Géigesaz zu Wierbeldéieren gëtt allgemeng ugeholl, datt Insekten net un männlech-biaséierte Geschlechtssteroidhormonen leiden. Bei Anopheles gambiae schéngt den Ecdyson-Steroid 20-Hydroxyecdyson (20E) sech entwéckelt ze hunn, fir d'Entwécklung vun den Eeër ze kontrolléieren, wann en duerch Weibercher synthetiséiert gëtt2, an eng Paarungsrefraktärperiod ze induzéieren, wann en duerch Männercher sexuell iwwerdroe gëtt3. Well d'Entwécklung an d'Paarung vun den Eeër essentiell reproduktiv Charakteristiken sinn, kéint d'Verständnis, wéi weiblech Anopheles-Moskitoen dës hormonell Signaler integréieren, d'Entwécklung vun neie Malaria-Kontrollprogrammer erliichteren. Hei weisen mir, datt dës reproduktive Funktiounen duerch verschidde Geschlechtssteroiden duerch e komplex Netzwierk vun Ecdysteroid-aktivéierenden/inaktivéierenden Enzymer reguléiert ginn. Mir hunn e männlech-spezifescht oxidéiert Ecdyson, 3-Dehydro-20E (3D20E), identifizéiert, dat d'Eltereschaft schützt, andeems et d'sexuell Empfänglechkeet vun de Weibercher no sexueller Transfert an Aktivéierung duerch Dephosphoryléierung ofschalt. Besonnesch den 3D20E-Transfer huet och d'Expressioun vu reproduktive Genen induzéiert, déi d'Entwécklung vun den Eeër während der Plasmodium-Infektioun erhalen, wat d'Gesondheet vun infizéierte Weibercher garantéiert. Vum Weiberchen ofgeleeten 20E verursaacht keng sexuell Reaktioun, awer erlaabt et de Paarungsmécken, Eeër ze leeën, nodeems d'20E-hemmende Kinasen inhibéiert sinn. D'Identifikatioun vun dësem männlech-spezifeschen Insektensteroidhormon a senger Roll bei der Reguléierung vun der sexueller Empfänglechkeet, der Fruchtbarkeet an der Interaktioun mat Plasmodium bei Fraen weist op de Potenzial hin, den reproduktive Succès vu Malaria-iwwerdroende Moustiquen ze reduzéieren.
Malariafäll a Stierffäll sinn erëm am Opstig4 wéinst der verbreeter Insektizidresistenz bei Anopheles-Moustiquen, dem eenzege Vektor vu mënschleche Malariaparasiten. D'Paarungsbiologie vun dëse Moustiquen ass e besonnesch attraktivt Zil fir nei Malariakontrollinterventiounen, well d'Weibercher sech nëmmen eemol paaren5; dëst eenzegt Paarungsevenement steril ze maachen hätt e grousst Potenzial fir d'Moustiquepopulatiounen am Feld ze reduzéieren.
Frae gi sexuell onfäeg, nodeems se Steroidhormone mat héijem Titer vu Männer kréien. Studien hunn gewisen, datt den Ausléiser fir Schwieregkeeten bei der weiderer Paarung 20-Hydroxyecdyson (20E) ass, en Steroidhormon, dat besser als Reguléierer vum Häuschungszyklus am Larvestadium bekannt ass. D'Fäegkeet vu Männercher, 20E ze synthetiséieren an ze transferéieren, huet sech speziell an Anopheles-Aarten entwéckelt, déi Deel vum Ënnergenus Cellia7 sinn, deen an Afrika verbreet ass an déi geféierlechst Vektore vu Malaria enthält, dorënner Anopheles gambiae. Dëst ass besonnesch bemierkenswäert, well bei dësen Aarte Weibercher och 20E no all Bluttmoolzecht produzéieren, an 20E den Oogenesezyklus steiert (kuckt Ref. 8). Wéi och ëmmer ass wéineg bekannt iwwer d'Aart a Weis, wéi Weibercher Signaler vun zwou verschiddene Quelle vun Ecdyson integréieren (Männertransfer a Blutternährungsinduktioun) ouni hir eege Fäegkeet ze kompromittéieren, sech ze paaren. Tatsächlech, wann den 20E, deen vun de Weibercher produzéiert gëtt, sexuell Intoleranz ausléist, féiert dëst zu Onfruchtbarkeet bei jonkfraegerechten Individuen, e ganz heefegt Verhalen bei dëse Moustiquen5.
Eng méiglech Erklärung ass, datt d'Männercher vun A. gambiae e modifizéierten, männlech-spezifeschen Ecdyson iwwerdroen, deen eng Signalkaskade am weiblechen Fortpflanzungstrakt aktivéiert, wat zu enger Instabilitéit an der Paarung féiert. Obwuel Wierbeldéieren verschidde Steroidhormone hunn, wéi Östrogen an Androgen (iwwerpréift a Referenz 9), goufen, souwäit mir wëssen, androgen-biaséiert Steroiden net bei Insekten identifizéiert.
Mir hunn eis virgeholl, de Repertoire vu Steroidhormonen an der männlecher Accessoiredrüs (MAG) vu sexuell reife A. gambiae ze bestëmmen, fir no méigleche modifizéierende Steroiden ze sichen. Mat Hëllef vun Héichleistungsflëssegkeetschromatographie gekoppelt mat Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS) anstatt der manner spezifescher Method, déi virdru benotzt gouf, hu mir Ecdyson (E) an 20E an dësem Gewief detektéiert, wat dat viregt Resultat bestätegt huet. Wéi och ëmmer, d'Prouf gouf vun oxidéierte phosphoryléierte Steroiden dominéiert, déi mat der Formel 3-Dehydro-20E-22-phosphat (3D20E22P)12 konsequent sinn (Figur 1). Aner Forme sinn 3-Dehydro-20E (3D20E) an 20E-22-phosphat (20E22P). D'HPLC-MS/MS Signalintensitéit vun 3D20E22P war zwou Gréisstenuerdnungen méi héich wéi seng dephosphoryléiert Form, 3D20E, an dräi Gréisstenuerdnungen méi héich wéi déi vun E an 20E (Figur 1). Och wann an aneren Deeler vum Kierper an dem ... ënneschten Fortpflanzungstrakt (LRT; Extended Data Fig. 1a). Mir hunn och Ekdysteroiden a nei zouenen (<1 Dag al) Männercher a Weibchen analyséiert an nëmmen 3D20E an 3D20E22P am MAG detektéiert; E, 20E an 20E22P ware bei béide Geschlechter präsent (Extended Data Fig. 1b). Dës Donnéeë suggeréieren, datt erwuesse Männercher vun A. gambiae héich Titere vu modifizéierende Hormonen an hire MAGs produzéieren, déi net vu Weibchen synthetiséiert ginn.
MAG a weiblech LRT (inklusiv Atrien, Samenbläschen a Parovarium) goufen aus 4 Deeg ale (4 Deeg ale) jonkfrae Männercher a jonkfrae a gepaarte Weibercher (0,5, 3 an 12 hpm) dissekéiert. Ecdyson an dëse Gewëss gouf duerch HPLC-MS/MS analyséiert (Moyenne ± Sem; ongepaarten t-Test, zweesäiteg, falsch Entdeckungsquote (FDR) korrigéiert; NS, net signifikant; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 Stonnen vs. 0,5 Stonnen, P = 0,035; 12 Stonnen vs. 3 Stonnen, P = 0,0015; 12 Stonnen vs. 0,5 Stonnen, P = 0,030. 3D20E22P: 3 Stonnen vs. 0,5 Stonnen, P = 0,25; 12 Stonnen vs. 3 Stonnen, P = 0,0032; 12 Stonnen vs. 0,5 Stonnen, P = 0,015). D'Donnéeë stamen aus dräi biologesche Widderspréch. D'Peakfläch fir all Ecdyson vun Interesse gouf berechent a normaliséiert duerch d'Zuel vun de Moustiquen. Ecdyson gëtt duerch Faarf wéi follegt duergestallt: E, gréng; 20E, orange; 20E22P, violett; 3D20E, blo; 3D20E22P, rosa. Den Asaz erhéicht d'Skala op der y-Achs fir méi niddreg Ecdysonniveauen ze weisen.
Fir z'ënnersichen, ob 3D20E22P an 3D20E während der Paarung transferéiert ginn, hu mir weiblech LRTs zu verschiddenen Zäitpunkten no der Paarung dissekéiert. Och wann Ecdyson net bei Jongfraen fonnt gouf, hu mir substantiell Quantitéiten un 3D20E22P am LRT direkt no der Paarung observéiert (0,5 Stonnen no der Paarung, hpm), déi mat der Zäit erofgaange sinn, während d'3D20E-Niveauen däitlech eropgaange sinn (Fig. 1). Mat chemesch synthetiséiertem 3D20E als Standard hu mir festgestallt, datt d'Niveaue vun dësem Steroidhormon an de Paarungs-LRTs op d'mannst 100-mol méi héich waren wéi 20E (Erweidert Datentabell 1). Dofir ass 3D20E22P dat wichtegst männlecht Ecdyson, dat während der Paarung op de weiblechen LRT transferéiert gëtt, a seng dephosphoryléiert Form, 3D20E, gëtt kuerz no der Paarung ganz reichlech. Dëst weist op eng wichteg Roll fir dat leschtgenannt Ecdyson an der Biologie vun de weibleche no der Paarung hin.
Nodeems mir en neien RNA-Sequenzéierungsdatensatz (RNA-seq) (Fig. 2a) generéiert haten, hu mir mat Hëllef vun enger speziell entwéckelter Bioinformatik-Pipeline no Ecdyson-Kinase (EcK), Ecdyson-Oxidase (EO) an Ecdyson gesicht, déi fir den 20E-modifizéierte Phosphatase-Gen kodéieren. (EPP) gëtt a reproduktive Gewëss expriméiert. Mir hunn ee Kandidat-EPP-Gen an zwee potenziell EcK-Genen (EcK1 an EcK2) identifizéiert, awer konnten kee gudde Kandidat-EO-Gen fannen. Bemierkenswäert ass, datt individuell EPP-Genen a groussen Niveauen (98,9. Perzentil) a gambesche MAGs expriméiert goufen, awer net a weiblechen LRTs (Fig. 2b), am Géigesaz zu eise Erwaardungen, well d'Dephosphoryléierung vun 3D20E22P an dësem weiblechen Gewëss stattfonnt huet. Dofir gleewen mir, datt männlecht EPP während der Paarung iwwerdroe ka ginn. Tatsächlech hu mir in vivo stabil Isotop-Markéierung benotzt fir dat weiblecht Protein no der Paarung ze maskéieren, en Enzym, dat duerch MS am weiblechen Atrium identifizéiert gouf (Fig. 2c an Ergänzungs-Tabell 1). D'Präsenz vun EPP a MAG a gepaarten (awer net virgineschen) weiblechen LRT gouf och mat spezifeschen Antikörper bestätegt (Fig. 2d).
a, Eng speziell entwéckelt Bioinformatik-Pipeline fir d'Reproduktiounsgewebe vun all Geschlecht no Genen ze sichen, déi EcKs, EOs an EPPs kodéieren. D'Zuelen nieft de Pfeiler weisen d'Zuel vu männlechen a weibleche Kandidaten an all Schrëtt un. Dës Analyse huet een EPP-Gen (EPP) an een EcK-Gen (EcK1) identifizéiert, déi bei Männercher expriméiert ginn, an een EcK-Gen (EcK2), dat bei béide Geschlechter expriméiert gëtt, awer kee Kandidat-EO-Gen ergëtt. b, Heatmap, déi d'Kandidat-Genexpression a virgineschen (V) an a Paarungs- (M) Anopheles gambiae an Anopheles albicans Gewëss vergläicht. Spca, Befruchtung; MAGs, Accessoirendrüsen bei Männercher; aner Deeler vum Kierper, dorënner Broscht, Flilleken, Been, Fettkierper an intern Organer bei béide Geschlechter, an Eierstöck bei Weibchen. EcK2 gëtt staark souwuel am MAG wéi och an den Atrien vu Gambia expriméiert, während EPP nëmmen am MAG fonnt gëtt.c, Proteomikanalyse vun der Translokatioun vun der männlecher Ejakulatgrupp an d'weiblech Atrien no 3, 12 an 24 hpm, déi déi 67 heefegst Proteinen weist. Weibchen goufen op enger Diät mat 15N opgezuucht, fir all Proteinen ze markéieren (a maskéieren). Net markéiert Männercher goufen mat markéierte Weibchen gepaart, a weiblech LRTs goufen no 3, 12 an 24 hpm fir eng proteomik Analyse dissekéiert (kuckt d'Ergänzungstabell 1 fir eng komplett Lëscht vun ejakulatoresche Proteinen). Inset, EPP, Eck1 an EcK2 goufen am MAG vu jonke Männercher duerch proteomik Analyse vun dëse Gewëss detektéiert.d, EPP gouf duerch Western Blot am MAG an LRT vu gepaarte Weibchen detektéiert, awer net a jonke Weibchen oder Männercher oder dem Rescht vum weibleche Kierper. Membranen goufen gläichzäiteg mat Anti-Aktin (Ladekontroll) an Anti-EPP-Antikörper getest. All Männer sinn Jongfraen. Kuckt d'Ergänzungsfigur 1 fir Gelquelldaten. Western Blots goufen zweemol mat ähnleche Resultater duerchgefouert.
D'Aktivitéit vun der Ekdysteroidphosphophosphatase vun EPP gouf no der Inkubatioun duerch HPLC-MS/MS mat 3D20E22P, dat aus MAG isoléiert gouf, verifizéiert (Extended Data Fig. 2a). Ausserdeem, wéi mir EPP duerch RNA-vermittelte Interferenz (RNAi) ausgeschalt hunn, hu mir eng staark Reduktioun vun der Phosphataseaktivitéit an de reproduktive Gewëss vun dëse Männchen festgestallt (Fig. 3a), a Weibercher, déi mat EPP-ausgeschaltene Männchen gepaart goufen, hunn e signifikanten méi niddrege Prozentsaz vun dephosphoryléiertem 3D20E gewisen (Fig. 3b), trotz partieller Gen-Ausschaltung (Extended Data Fig. 2b,c). Am Géigesaz dozou hu mir keng signifikant Ännerungen am 20E22P/20E-Verhältnis bei de selwechte Moustiquen festgestallt, wat drop hiweise kéint, datt den Enzym spezifesch fir 3D20E22P ass (Fig. 3b).
a, Verréngert Phosphataseaktivitéit am MAG verursaacht duerch EPP-Silencing mat Hëllef vun duebelsträngeger EPP RNA (dsEPP) oder duebelsträngeger GFP RNA (dsGFP) Kontrollen. Zwanzeg MAG-Pools goufen an all Replikat benotzt (P = 0,0046, gepaarten t-Test, zweesäiteg), representéiert duerch separat Punkten.b, Weibercher, déi mat EPP-gestëllten Männercher gepaart goufen, haten e signifikant méi niddrege Prozentsaz vun dephosphoryléiertem 3D20E bei 3 hpm (P = 0,0043, ongepaarten t-Test, zweesäiteg), während d'20E-Niveauen net beaflosst goufen (P = 0,063, ongepaarten). t-Test, zweesäiteg). D'Donnéeë ginn als Moyenne ± Sem aus dräi Gruppe vun 13, 16 an 19 Weibchen presentéiert.c, Weibchen, déi mat EPP-stilgemaachte Männercher gepaart goufen, haten däitlech méi héich Raten vun der Widderpaarung (P = 0,0002, Fisher's exact Test, zweesäiteg). D'Weibchen goufen als éischt gezwongen, sech ze paaren, fir hire Paarungsstatus ze garantéieren; 2 Deeg méi spéit goufe si mat anere Männchen, déi transgen Spermien droen, a Kontakt bruecht, fir d'Wiederpaarungsraten duerch quantitativ PCR-Detektioun vum Transgen ze evaluéieren.d, Bluttgefidderte Weibercher, déi mat EPP-stilgemaachte Männchen gepaart goufen, haten eng däitlech reduzéiert Fruchtbarkeet (P < 0,0001; Mann-Whitney-Test, zweesäiteg) an eng liicht reduzéiert Zuel vun den Eeër (P = 0,088, Mann-Whitney-Test, zweesäiteg), während d'Laichquote net beaflosst war (P = 0,94, Fisher-exakten Test, zweesäiteg). An alle Panelen representéiert n d'Zuel vun biologesch onofhängege Moustiqueprouwen.NS, net signifikant.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Duerno hu mir ënnersicht, ob d'Ecdyson-Dephosphoryléierung wichteg ass fir d'Parungsresistenz bei Weibchen ze induzéieren. Bemierkenswäert ass, datt Weibchen, déi mat EPP-ofgebauten Männercher gepaart goufen, mat enger vill méi héijer Frequenz (44,9%) nei gepaart hunn wéi Kontrollweibchen (10,4%), wa se zousätzlechen (transgenen) Männercher ausgesat waren (Fig. 3c). Mir hunn och eng bedeitend Ofsenkung vun der Fruchtbarkeet observéiert (Fig. 3d, lénks) an eng liicht Ofsenkung vun der Unzuel vun den Eeër, déi vun dëse Weibchen geluecht goufen (Fig. 3d, Mëtt), während de Prozentsaz vun den Eeër, déi vu Weibchen geluecht goufen (eng aner Reaktioun, déi bei Weibchen duerch d'Parung ausgeléist gouf) net beaflosst gouf (Fig. 3d, riets). Wéinst der observéierter Spezifizitéit vun EPP fir 3D20E22P suggeréieren dës Resultater, datt d'Aktivéierung vun 3D20E duerch EPP, déi während der Parung transferéiert gëtt, eng wichteg Roll bei der Ausschaltung vun der Rezeptivitéit vun de Weibchen fir weider Paarung spille kann, e Verhalen, dat virdru dem sexuellen Transfer vun 20E zougeschriwwen gouf. Dofir beaflosst dëst männlech-spezifescht Hormon och d'Fruchtbarkeet vun de Weibchen staark.
Duerno hu mir d'Aktivitéite vun 20E an 3D20E an Injektiounsexperimenter bei sexuell reife Jongfraen verglach, andeems mir chemesch synthetiséierten 3D20E (Fig. 4a-c) a kommerziell verfügbaren 20E benotzt hunn. Mir hunn observéiert, datt 3D20E däitlech méi effektiv war wéi 20E fir d'Sensibilitéit vun de Weibercher fir d'Paarung bei béide Konzentratiounen auszeschalten (Fig. 4d). Bemierkenswäert ass, datt d'Halschent vum physiologesche Niveau vun 3D20E am LRT (1.066 pg no der Injektioun vs. 2.022 pg no der Paarung) en Undeel vu refraktäre Weibercher induzéiert huet, deen 20-mol méi héich war wéi de physiologesche Niveau vun 20E (361 pg no der Injektioun) 24 Stonnen no der Injektioun bei der héchster Konzentratioun vun 18 pg no der Paarung; Erweidert Datentabell 1). Dëst Resultat entsprécht der Iddi, datt de sexuellen Transfer vun 20E keng Paarungsrefraktärperioden verursaacht, a weist weider op 3D20E als e wichtege Faktor fir d'Elteren-Kand-Bezéiung ze garantéieren. 3D20E war och däitlech méi aktiv wéi 20E an Eeërlee-Tester bei jonke Weibchen (Fig. 4e), wat drop hiweist, datt déi normal Eeërlee-Rate, déi mir no partieller EPP-Ausschaltung observéiert hunn, op d'Präsenz vun der Rescht-3D20E-Aktivitéit zréckzeféieren ass, déi nach ëmmer duerch Paarungs-induzéiert weiblech Faktoren produzéiert gouf.
(a,b) 3D20E chemesch synthetiséiert aus 20E (a) mat ganz héijer Konversioun/Effizienz (Donnéeën presentéiert als Moyenne ± Sem vun dräi onofhängege Synthesereaktiounen) (b).c, Massespektrum (ënnescht Hallschent) entsprécht exakt dem Ecdyson, deen a gepaarte weiblechen LRT fonnt gouf (iewescht Hallschent).d, Am Verglach mat 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisher's exact Test, zweesäiteg) an 10% Ethanol (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisher's exact Test, zweesäiteg), während 20E nëmmen bei méi héijen Dosen (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fisher's exact Test, zweesäiteg) signifikant méi héich war wéi d'Kontroll. D'Injektioun huet däitlech méi héich Laichraten bei jonke Weibchen induzéiert wéi bei Kontrollpersounen mat 10% Ethanol (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fisher's exact Test, zweesäiteg), während 20E nëmmen bei méi héijen Dosen am Verglach mat Kontrollpersounen war (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fisher's exact Test, zweesäiteg).3D20E huet däitlech méi héich Laichraten induzéiert wéi 20E bei méi héijen Dosen (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fisher's exact Test, zweesäiteg). An alle Panelen representéiert n d'Zuel vun de biologesch onofhängege Moustiqueprouwen. NS, net signifikant. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. D'Donnéeë stamen aus dräi Replikater.
A fréiere Studien hu mir festgestallt, datt de sexuellen Transfer vu Steroidhormonen d'Expressioun vu MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) induzéiert, engem weibleche Reproduktiounsgen, dat d'Weibercher vun A. gambiae virun enger P. falciparum-Infektioun schützt. Gesondheetskäschte verursaacht duerch 13, dem déidlechste mënschleche Malariaparasit. Wéinst der Wichtegkeet vu MISO fir d'reproduktiv Fitness vun Anopheles a malariaendemesche Gebidder, hu mir decidéiert ze bestëmmen, wéi en Hormon 3D20E oder 20E d'Expressioun vun dësem Gen ausléist. Mir hunn festgestallt, datt, während d'20E-Injektioun spezifesch oder méi staark e puer Nuklearhormonrezeptoren (HR), wéi HR3 an HR4, an typesch Downstream-Steroidziler, wéi d'Gielogengenen Vg14, 15, 16, induzéiert huet, MISO méi staark duerch 3D20E induzéiert gouf (Erweidert Daten Fig. 3). Dofir schéngt de sexuellen Transfer vun dësem androgenen Steroidhormon Mechanismen ze induzéieren, déi d'Weibercher virun de Käschte schützen, déi duerch eng parasitär Infektioun entstinn. Ausserdeem beaflosst 3D20E differenziell béid Isoformen vun der ... E-Rezeptor EcR, wat EcR-A induzéiert an EcR-B ënnerdréckt, an aner Paarungs-induzéierend Genen méi staark ausléist, dorënner HPX15, wat d'Fruchtbarkeet vun de Fraen beaflosst. Dëst kéint déi bedeitend Onfruchtbarkeet erklären, déi bei Weibchen observéiert gouf, déi mat EPP-gesilberte Männercher gepaart goufen (Erweidert Donnéeën Fig. 3). Dës Donnéeë suggeréieren d'Existenz vun Downstream-Weeër, déi bevorzugt vun zwee Ecdyson-Hormonen aktivéiert ginn, déi der geschlechtsspezifescher Funktioun zugronn leien.
Duerno hu mir d'Funktioun vun den zwou EcK-Genen getest, déi an eiser Bioinformatik-Pipeline identifizéiert goufen. D'Stillen vun EcK1 oder EcK2 huet zu enger bedeitender Mortalitéit bei Männer gefouert (Extended Data Fig. 4a), wat drop hiweist, datt d'Ecdysonphosphoryléierung, an domat d'Inaktivéierung, wichteg fir d'Iwwerliewe ass. Well EcK2 a méi héijen Niveauen expriméiert gouf wéi EcK1 a mat Proteomik a MAGs nogewise gouf (Fig. 2b,c an Ergänzungstabell 2), hu mir seng Ecdysteroid-Kinase-Aktivitéit validéiert andeems mir se mat 20E inkubéiert hunn, wat zu enger Phosphoryléierung vun 20E22P gefouert huet (Extended Data Figur 2).4b). Wann mir 3D20E als Substrat benotzt hunn, konnten mir dat phosphoryléiert Produkt 3D20E22P net nogewise ginn (Extended Data Fig. 4c), wat drop hiweist, datt 20E anstatt 3D20E dat bevorzugt Zil vun EcK2 kéint sinn.
Laut eiser RNA-Seq-Analyse gouf EcK2 och staark am LRT vu jonke Weibchen expriméiert, wou et no der Paarung ausgeschalt gouf (Fig. 2b). Mir hunn dës Donnéeën confirméiert a festgestallt, datt d'EcK2-Expressioun net duerch Bluttnahrung beaflosst gouf (Extended Data Fig. 5a). Mir hunn eis initial MS-Experimenter erweidert a festgestallt, datt de Peak vun 20E22P enk mam Peak vun 20E verbonnen war (22-26 Stonnen no der Bluttmoolzecht; Extended Data Fig. 5b). D'Stëllung vun EcK2 bei jonke Weibchen huet zu enger dräifacher Erhéijung vum relative Verhältnis vun 20E zu 20E22P 26 Stonnen no der Bluttmoolzecht gefouert (Extended Data Figuren 2c a 5c), wat bestätegt, datt EcK2 och 20E bei Weibchen phosphoryléiert. Bemierkenswäert ass, datt EcK2-ofgebaute Jongfrae voll sexuell Empfänglechkeet behalen hunn (Extended Data Fig. 5d,e), wat weider drop hiweist, datt d'Produktioun vun 20E bei Weibchen keng Paarungsrefraktärperioden induzéiert. Dës Weibchen haten awer bedeitend ... erhéicht Eeërleegraten am Verglach mat der Kontrollgrupp, mat méi wéi 30% vun de Jongfraen, déi Eeër geluecht hunn (Extended Data Fig. 5f). Wann duebelsträngeg Eck2 RNA (dsEcK2) Injektiounen no der Blutternierung duerchgefouert goufen, ass d'Laichzäit net opgetrueden, wouropshin den 20E-Peak wéinst der Blutternierung erofgaangen ass. Am Allgemengen ënnerstëtzen dës Resultater e Modell, datt 20E, dat nom Bluttsaugen produzéiert gëtt, d'Laichzäit induzéiere kann, awer nëmmen wann de Laichblock (EcK2 a méiglecherweis aner Faktoren) duerch d'Paarung ausgeschalt gëtt. Weder 20E nach 3D20E Injektiounen hunn d'EcK2-Expressioun bei Jongfraen inhibéiert (Extended Data Fig. 5g), wat drop hiweist, datt aner Faktoren d'Inhibitioun vun dëser Kinase verursaachen. Wéi och ëmmer, d'20E-Niveauen no der Blutternierung waren net genuch fir Paarungsbeschwerden ze induzéieren, mä goufen effektiv duerch héich Titeren vun sexuell iwwerdroenem 3D20E ausgeléist.
Eis Resultater liwweren wichteg Abléck an d'Mechanismen, déi den reproduktive Succès vun A. gambiae reguléieren. E Modell ass entstanen, wou Männercher sech entwéckelt hunn, fir héich Titeren vun 3D20E ze synthetiséieren, engem männlech-spezifesche modifizéierten Ecdyson, deen d'Obstänn garantéiert, andeems d'Weibercher fir weider Paarung desensibiliséiert ginn. Gläichzäiteg hunn dës Malariavektoren och en effiziente System entwéckelt, fir 3D20E bei Weibercher als Äntwert op den sexuellen Transfer vu männlech-spezifeschem EPP z'aktivéieren. No eisem Wëssen ass dëst dat éischt Beispill vun engem männlech- a weiblechen dominéierte Steroidhormonsystem, dat eng eenzegaarteg a kritesch Funktioun bei Insekten ausféiert. Déi männlech-spezifesch Ecdysonfunktioun gouf postuléiert, awer net definitiv nogewisen. Zum Beispill ass eng gréisstendeels widderluecht Hypothese 18, datt dës Funktiounen vum 20E-Virleefer E1 ausgeführt kënne ginn. Et ass bekannt, datt bei Drosophila Monandry duerch den sexuellen Transfer vu klenge Geschlechtspeptiden 19,20 ausgeléist gëtt, déi mat Neuronen interagéieren, déi de weiblechen Fortpflanzungstrakt iwwer spezifesch Geschlechtspeptidrezeptoren 21,22 innervéieren. Weider Aarbecht ass néideg, fir d'Downstream-Signalgebung ze bestëmmen. Kaskaden, déi vun 3D20E a Weibchen vun A. gambiae kontrolléiert ginn, a fir ze bestëmmen, ob dës Kaskaden tëscht Moustiquen an Drosophila konservéiert kënne ginn.
Wéinst der wichteger Roll vum 3D20E op d'Fruchtbarkeet a Verhalen vu Fraen, déi an eiser Studie identifizéiert goufen, bidden d'Weeër, déi zur 3D20E-Synthese an -Aktivéierung féieren, nei Méiglechkeete fir zukünfteg Moustiquebekämpfungsstrategien, wéi d'Generatioun vu kompetitive sterile Männchen a sterilen Insektentechnologiestrategien, déi fir d'Fräisetzung an der Wild benotzt ginn oder fir den 3D20E am Spill mat jonke Fraen z'imitéieren. Déi männlechspezifesch Funktioun vum 3D20E kéint sech entwéckelt hunn, wéi A. gambiae an aner Cellia-Aarten d'Fäegkeet kruten, hire Spermien a Paarungspluggen ze koaguléieren, well dëst den effizienten Transfer vu groussen Zuelen un Hormonen an hormonaktivéierenden Enzymen erméiglecht. Dofir bitt d'3D20E-Evolutioun, déi Monandry implementéiert, e Mechanismus fir d'Weibercher (duerch eng héich Expressioun vu MISO), fir hir reproduktiv Fitness a Gebidder mat héijer Malariaprävalenz ze favoriséieren, wat indirekt zur Plasmodium-Iwwerdroung bäidréit. Well gewisen ass, datt de weiblechen 20E e groussen Afloss op d'Iwwerliewe a Wuesstum vu P. falciparum bei weibleche Anopheles-Moustiquen huet,24 sinn elo souwuel männlech wéi och weiblech Steroidhormonweeër Schlësselaspekter vun de Moustique-Parasit-Interaktiounen.
A. gambiae G3-Stämme goufen ënner Standard-Insektenbedingungen geziicht (26-28 °C, 65-80% relativ Fiichtegkeet, 12:12 Stonnen Liicht/Däischter-Fotoperiod). D'Larve goufe mat pulveriséiertem Fëschfudder (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets an Tetra Pond Sticks am Verhältnes vun 7:7:2) gefiddert. Erwuesse Moustiquen kruten ad libitum eng 10% Dextrose-Léisung a wöchentlech mënschlecht Blutt (Bluttkomponenten fir d'Studie) gefiddert. Jungfrauenmücken goufen gewonnen andeems d'Geschlechter am Pupstadium getrennt goufen, nodeems d'Ennen duerch Mikroskopie ënnersicht goufen. Männchen, déi den DsRed-Transgen droen, goufen schonn virdru beschriwwen.
Gezwongen Paarungsexperimenter goufen no virdru beschriwwene Protokoller duerchgefouert. Fir d'natierlech Paarung goufen 4 Deeg al jonkfrae Weibchen an engem Verhältnes vun 1:3 mat sexuell reife jonkfrae Männercher fir zwou Nuechten gehalen. Fir Experimenter, bei deenen d'Männercher mat dsEPP injizéiert goufen, ass d'Co-Caging mat den Deeg 3-4 no der Injektioun zesummegefall, wéi d'Phosphataseaktivitéit maximal gestillt war (Erweidert Daten Fig. 2b).
Moustiquegewebe, verbleiwen Läichen (Rescht vum Kierper) oder de ganze Kierper goufen an 100% Methanol dissekéiert an mat engem Glasperlen (2 mm Glasperlen, 2.400 rpm, 90 Sekonnen) homogeniséiert. D'Gewëssquantitéiten an d'Methanolvolumen waren wéi follegt: Rescht vum Kierper, 50 an 1.000 µl; MAG, 50–100 80 µl; weiblech LRT, 25–50 80 µl. De Nidderschlag gouf enger zweeter Methanolextraktioun mam selwechte Volumen Methanol ënnerworf. Zellreschter goufen duerch Zentrifugatioun ewechgeholl. De Methanol aus béiden Extraktiounen gouf kombinéiert an ënner engem Stéckstoffstroum gedréchent, duerno an de folgende Volumen vun 80% Methanol a Waasser resuspendéiert: Rescht vum Kierper, 50 µl; MAGs a weiblech LRT, 30 µl.
D'Prouwe goufen op engem Massespektrometer (ID-X, Thermo Fisher) analyséiert, deen un en LC-Instrument (Vanquish, Thermo Fisher) gekoppelt war. 5 µl vun der Prouf goufen op eng 3 µm, 100 × 4,6 mm Kolonn (Inspire C8, Dikma) injizéiert, déi bei 25 °C gehale gouf. Déi mobil Phasen fir den LC waren A (Waasser, 0,1% Ameensäure) a B (Acetonitril, 0,1% Ameensäure). Den LC-Gradient war wéi follegt: 5% B fir 1 Minutt, dann iwwer 11 Minutten op 100% B erhéicht. No 8 Minutten bei 100%, d'Kolonn bei 5% B fir 4 Minutten nei ausbalancéieren. De Flossrate war 0,3 ml min-1. D'Ioniséierung an der MS-Quell gëtt duerch erhëtzt Elektrospray-Ioniséierung a positiven an negativen Modi duerchgefouert.
De Massespektrometer moosst Daten am m/z-Beräich vun 350 bis 680 mat enger Opléisung vun 60.000 am volle MS-Modus. MS/MS-Daten goufen op [M + H]+ (all Ziler), [M - H2O + H]+ (all Ziler) an [M - H]- (phosphoryléiert Ziler) gesammelt. MS/MS-Daten goufen benotzt fir d'Ecdyson-Eegeschafte vun Ziler ze bestätegen, fir déi kee Standard verfügbar war. Fir net-gezielt Ecdysteroiden z'identifizéieren, goufen MS/MS-Daten fir all HPLC-Peaken mat enger relativer Heefegkeet vun >15% analyséiert. Quantifizéiert mat Standardkurven, déi aus puren Standarden (20E, 3D20E) erstallt goufen, fir absolut Quantitéiten oder Verdënnungen vun enger spezifescher Prouf (all aner Ziler) ze berechnen, fir hir Äquivalenz mat de Quantitéiten, déi an engem männleche Prouf fonnt goufen, ze berechnen. Fir 3D20E gouf d'Quantifizéierung mat der Zomm vun de folgenden Addukter duerchgefouert: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. D'Donnéeë goufen extrahéiert a quantifizéiert mat Tracefinder (Versioun 4.1). MS/MS-Donnéeë goufen mat Xcalibur (Versioun 4.4) analyséiert. D'MS-Spektre vun E, 20E an 3D20E goufen mat de jeeweilege Standarden verglach. 3D20E22P gouf duerch Derivatiséierung mam Girard-Reagens analyséiert. 20E22P gouf nom m/z-Verhältnis analyséiert.
3D20E22P gouf aus MAG gereinegt. D'Reinigung gouf op analytescher Skala mat engem Ultra-Performance-Flëssegkeetschromatograph (Acquity, Waters) mat engem Quadrupol-Mass-baséierten Detektor (QDa, Acquity, Waters) ënner de selwechte LC-Konditioune wéi d'HPLC-MS/MS-Analyse duerchgefouert. D'Fraktiounssammlung gouf ausgeléist, wéi den m/z, deen dem 3D20E22P entsprécht, bei der selwechter Retentiounszäit wéi virdru bestëmmt detektéiert gouf. D'Reinheet vun den extrahéierte Verbindungen gouf dann duerch HPLC-MS/MS iwwerpréift, wéi uewe beschriwwen.
Total RNA gouf aus 10-12 reproduktive Gewëss oder aner Kierperdeeler (ouni Kapp) mat engem TRI-Reagens (Thermo Fisher) extrahéiert, no den Instruktioune vum Hiersteller. D'RNA gouf mat TURBO DNase (Thermo Fisher) behandelt. cDNA gouf mat der Moloney-Maurin-Leukämievirus-Reverse-Transkriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) synthetiséiert, no den Instruktioune vum Hiersteller. Primer fir d'quantitativ PCR vun der Reverse-Transkriptioun (RT-qPCR; Extended Data Table 2) goufen virdru publizéiert24 oder mat Primer-BLAST26 entwéckelt, mat Präferenz fir Produkter mat enger Gréisst vun 70-150 bp, déi Exon-Exon-Verbindungen ëmfaassen, oder Primerpaarprimer trennen Exonen. cDNA-Prouwen aus dräi bis véier biologesche Replikater goufen véierfach a Waasser fir RT-qPCR verdënnt. D'Quantifizéierung gouf a 15 µl Replikat-Reaktiounen duerchgefouert, déi 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), Primer a 5 µl verdënnte cDNA enthalen. D'Reaktioune goufen op engem QuantStudio 6 Pro Echtzäit-Gerät duerchgefouert. E PCR-System (Thermo Fisher) an d'Donnéeë goufen mat Design and Analysis (Versioun 2.4.3) gesammelt an analyséiert. Wéi an dëser Studie gewisen, goufen déi relativ Quantitéiten op dat ribosomalt Gen RpL19 (AGAP004422) normaliséiert, deem seng Expressioun sech net signifikant mat Blutternierung 27 oder Paarung 3 geännert huet.
D'RNA-Qualitéit gouf mat engem Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) iwwerpréift. Illumina Paired-End-Bibliothéike goufen am Broad Institute vun MIT an Harvard virbereet a bedriwwen. Sequenzéierungsliesungen goufen mam A. gambiae-Genom (PEST-Stamm, Versioun 4.12) mat HISAT2 (Versioun 2.0.5) mat Standardparameteren ausgeriicht. Liesungen mat Mapping-Qualitéitswäerter (MAPQ) <30 goufen mat Samtools (Versioun 1.3.1) ewechgeholl. D'Zuel vun de Liesungen, déi op Genen zougewise goufen, gouf mat htseq-count (Versioun 0.9.1) mat Standardparameteren gezielt. Normaliséiert Lieszuelen goufen berechent an d'Differenzialgenexpression gouf mat dem DESeq2-Package (Versioun 1.28.1) an R (Versioun 4.0.3) analyséiert.
Ecdyson-modifizéierend Genkandidaten goufen identifizéiert andeems fir d'éischt de Genom vun A. gambiae mat dem PSI-BLAST Algorithmus (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) duerchsicht gouf, mat Standardwäerter Parameteren an de folgende Query-Proteinsequenzen: vu Bombyx mori (Accessiounsnummer NP_001038956.1), Musca domestica (Accessiounsnummer XP_005182020.1, XP_005175332.1 an XP_011294434.1) a Microplitis demolitor (Accessiounsnummer XP_008552646.1 an XP_008552645.1) EcK vu B. mori (Accessiounsnummer NP_001036900), Drosophila melanogaster (Accessiounsnummer NP_651202), Apis mellifera (Accessiounsnummer XP_394838) an Acyrthosiphon pisum (Accessiounsnummer XP_001947166); an EPP vu B. mori (Accessiounsnummer XP_001947166) NP_001177919.1 an NP_001243996.1) an EO vun D. melanogaster (Accessiounsnummer NP_572986.1) (Schrëtt 1). Duerno ginn d'Treffer baséiert op héijer mRNA-Expressioun (>100 Fragmenter/Kilobasen-Exonen pro Millioun mapped reads (FPKM) oder >85%) am reproduktive Gewëss (weiblech LRT oder MAG) a Gambia gefiltert (Schrëtt 2). Fir d'Spezifikitéit ze verbesseren, hu mir Kandidatenzymer ausgewielt, déi och am reproduktive Gewief vun A. albimanus expriméiert ginn, enger Anopheles-Aart, déi während der Paarung keen Ecdyson synthetiséiert oder transferéiert. Kandidatengenen goufen op Basis vun hirer gerénger Expressioun (<100 FPKM oder <85. Perzentil) am reproduktive Gewief vun A. albimanus gefiltert (Schrëtt 3). Als leschte Filter (Schrëtt 4) mussen d'Kandidatengenen op d'mannst ee vun de folgenden erfëllen: (1) signifikant no der Paarung eropreguléiert (P < 0,05) laut der Analyse vun differentiell expriméierte Genen an (2) an net-reproduktive Gewiefer (< 85 % oder <100 FPKM).
Mir hunn déi virdru beschriwwe Methoden 28,29,30 modifizéiert fir d'Isotopenmarkéierung vum ganze Organismus z'erreechen. Kuerz gesot, gouf de Wildtyp Saccharomyces cerevisiae Typ II (YSC2, Sigma) an enger Hefstickstoffbasis (BD Difco, DF0335) getest, déi (Gew./Vol.) 2% Glukos (G7528, Sigma), 1,7% Aminosaierfräiem Kulturmedium) a 5% 15N Ammoniumsulfat (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) als eenzeg Stéckstoffquell enthält. D'Hef gouf duerch Zentrifugatioun gewonnen an d'Moskittelarve goufen ad libitum bis zur Verpopfung gefiddert. Ergänzung mat Fëschmiel (0,5 mg pro 300 Larven) fir d'Mortalitéit am véierte Stadium ze vermeiden. Nëmme Weibchen goufen duerno a Paarungsexperimenter mat onmarkéierte Männercher benotzt fir de männleche Proteom ze analyséieren, deen während der Paarung transferéiert gouf.
4-6 Deeg al 15N-markéiert jonk Weibchen goufen gezwongen, sech mat altersgerechten, net-markéierten jonke Männercher ze paaren. Déi erfollegräich Paarung gouf verifizéiert andeems Paarungsproben ënner Epifluoreszenzmikroskopie entdeckt goufen. No 3, 12 an 24 Minutten goufen d'Atrien vu 45-55 gepaarte Weibchen an 50 µl Ammoniumbikarbonatpuffer (pH 7,8) dissekéiert an mat enger Pistill homogeniséiert. Den Homogenat gouf zentrifugéiert an den Iwwerstand mat 50 µl 0,1% RapiGest (186001860, Waters) a 50 mM Ammoniumbikarbonat gemëscht. Den Iwwerstand an de Pellet aus all Prouf goufen op Dréchenäis séier agefruer an iwwer Nuecht an de MacCoss Laboratoire vun der University of Washington geschéckt, wou d'Proufvirbereedung fir LC-MS/MS ofgeschloss gouf. De Pellet resuspendéiert a 50 µl 0,1% RapiGest a 50 mM Ammoniumbikarbonat a sonikéiert an engem Waasserbad. D'Proteinkonzentratioun vum Pellet an dem Iwwerstand gouf mat der ... gemooss. BCA-Assay, Prouwe goufen mat 5 mM Dithiothreitol (DTT; Sigma) reduzéiert, mat 15 mM Iodacetamid (Sigma) alkyléiert an 1 Stonn bei 37 °C (1:0 50) mat Trypsiniséierung inkubéiert: Trypsin:Substrat-Verhältnis). RapiGest gouf duerch d'Zousätz vun 200 mM HCl lyséiert, gefollegt vun Inkubatioun bei 37 °C fir 45 Minutten an Zentrifugatioun bei 14.000 rpm fir 10 Minutten bei 4 °C fir d'Entfernung vu Reschter. D'Prouwe goufen duerch Duebelmodus-Festphasenextraktioun (Oasis MCX Patrounen, Waters) gewäsch an an 0,1% Amberesäure fir eng final Proteinkonzentratioun vun 0,33 µg µl-1 resuspendéiert. Onmarkéiert MAG-Proteomen goufen ähnlech vu jonke Männer analyséiert. Zwee analytesch Replikater goufen fir all Prouf analyséiert. Duerno gouf 1 µg vun all analyséiert mat enger 25 cm Schmelzkiseldioxid 75-μm Kolonn mat enger ... 4-cm geschmolzene Siliziumdioxid Kasil1 (PQ) Fritfalle gepackt mat Jupiter C12 Reverse-Phase-Harz (Phenomenex) an 180-Minutte Flëssegkeetschromatographie. Proufverdauungen – MS/MS gouf op engem Q-Exactive HF Massenspektrometer (Thermo Fisher) mat engem nanoACQUITY UPLC System (Waters) duerchgefouert. Datenbezunnen Acquisitiounsdaten, déi fir all Laf generéiert goufen, goufen an de mzML Format mat Proteowizard (Versioun 3.0.20287) a mat Comet31 (Versioun 3.2) géint d'FASTA Datebank mat Proteinsequenzen vun Anopheles gambiae (VectorBase Versioun 54), Anopheles coluzzi ëmgewandelt. Eng Sich gouf op Mali-NIH (VectorBase Versioun 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Mäerz 2021), A. gambiae RNA-seq, an Dräi-Frame Iwwersetzunge vu bekannte mënschleche Kontaminanten duerchgefouert. Peptidkaart-matched FDRs goufen mat Percolator32 (Versioun 3.05) mat engem Schwellwäert vun 0.01 bestëmmt, a Peptide goufen zu Proteinidentifikatiounen zesummegesat mat Proteinparsimony a Limelight33 (Versioun 2.2.0).Déi relativ Proteinhéicht gouf mat Hëllef vum normaliséierte spektrale Heefegkeetsfaktor (NSAF) geschat, deen fir all Protein an all Laf berechent gouf, wéi virdru beschriwwen.Den NSAF relativ zu all Protein gouf iwwer d'Prouwe vun zwou verschiddene biologesche Replikater gemittelt.D'15N-Markéierung huet de weibleche Proteom erfollegräich maskéiert, obwuel eng kleng Quantitéit un onmarkéiertem Protein vun de markéierte Virgins nogewise konnt ginn.Mir hunn d'Detektioun vun der männlecher Proteinreduktioun (1-5 Spektren) a weibleche Rohprouwen nëmmen an technesche Lafprozesser opgeholl, wou Rohprouwen no männlechen/Paarungsprouwen duerchgefouert goufen, als Resultat vum HPLC-"Carry-over".Heiansdo Proteinen, déi als 'Kontaminanten' vu markéierte Virgins fonnt goufen, sinn an der Ergänzungstabell 1 opgezielt.
Zwee antigen Peptide, QTTDRVAPAPDQQQ (am Isotyp PA) a MESDGTTPSGDSEQ (am Isotyp PA an PB) a Genscript. Déi zwee Peptide goufen kombinéiert, dann un d'Trägerprotein KLH konjugéiert an an neiséilännesch Kanéngercher injizéiert. D'Kanéngercher goufen no der véierter Injektioun geaffert, an den totalen IgG gouf duerch Affinitéitsreinigung isoléiert. IgG vum EPP-spezifeschste Kanéngchen gouf fir weider Western Blotting benotzt.
Fir Western Blots, MAG (n = 10, wou n d'Zuel vun biologesch onofhängege Moustiqueproben representéiert) a weiblech LRT (n = 30) vu 4 Deeg ale jonkfrae Männercher a jonkfrae oder gezwongen-gepaarte Weibercher (<10 no der Paarung), gouf Proteinextraktiounspuffer (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% Natriumdeoxycholat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× Protease-Inhibitor Cocktail (Roche)) separat bäigefüügt. D'Prouwe goufen direkt no der Dissektion mat engem Perlen (2 mm Glasperlen, 2.400 rpm, 90 Sekonnen) homogeniséiert. Onléislech Iwwerreschter goufen duerch Zentrifugatioun bei 20.000 g bei 4 °C ewechgeholl. Proteine ​​goufen duerch Bradford Assay (Bio-Rad) quantifizéiert. Duerno goufen 20 µg MAG Protein, 40 µg LRT Protein an 20 µg Reschtprotein denaturéiert a getrennt duerch 10% Bis-Tris NuPAGE mat MOPS-Puffer. Proteine ​​goufen op Polyvinylidenfluoridmembranen mat dem iBlot2 Transfersystem (Thermo Fisher) transferéiert. D'Membranen goufen zweemol an 1× PBS-T (0,1% Tween-20 a PBS) gewäsch an duerno fir 1 Stonn bei 22°C an Odyssey-Blockéierungspuffer (Li-Cor) blockéiert. D'Membranen goufen iwwer Nuecht bei 4°C mat engem personaliséierten polyklonalen primären Antikörper géint Kanéngchen-Anti-EPP (1:700 am Blockéierungspuffer) an engem monoklonalen primären Antikörper géint Ratten-Anti-Aktin MAC237 (Abeam; 1:4.000) gerëselt. D'Membranen goufen mat PBS-T gewäsch an duerno mat sekundären Antikörper (Iesel-Anti-Kanéngchen-800CW a Geess-Anti-Ratten-680LT (Li-Cor), béid 1:20.000) an engem Blockéierungspuffer mat 0,01% SDS an 0,2% Tween-20 fir 1 Stonn bei 22°C inkubéiert. °C. D'Membranen goufen mat PBS-T gewäsch an mat engem Odyssey CLx Scanner ofgebildt. D'Biller goufen am Image Studio (Versioun 5.2) gesammelt a veraarbecht. Eng spezifesch Band, déi dem EPP-RA Isoform (82 kDa) entsprécht, gouf net detektéiert.
Déi kodéierend Regioune vun EPP (als Isoform AGAP002463-RB mat Histidinphosphatase-Domän, NCBI conserved domain search 34) an EcK2 (AGAP002181) goufen an de Plasmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma) geklont; D'Primer sinn an der erweiderter Datentabell 2 opgezielt. Aacht GS4-Linker (am Tandem) goufen virum C-terminalen 6xHis-Tag vum pET-21a(+)-EcK2-Konstrukt agefouert. Rekombinant Proteine ​​goufen mat der NEBExpress zellfräier E. coli Proteinsynthesereaktioun (New England BioLabs) produzéiert. Rekombinant Proteine ​​goufen mat NEBExpress Ni-Spinsäilen (New England BioLabs) gereinegt. Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Kontrollprotein gouf mat enger DNA-Schabloun aus dem NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit produzéiert. Proteine ​​goufen a 50% Glycerin a PBS bei -20 °C fir bis zu 3 Méint gelagert.
D'Phosphataseaktivitéit vun EPP an Tissueextrakter gouf mat 4-Nitrophenylphosphat (pNPP; Sigma-Aldrich) gemooss. De Reaktiounspuffer huet 25 mM Tris, 50 mM Essigsäure, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA an 1 mM DTT enthale. D'Tissu gouf am Reaktiounspuffer homogeniséiert an Zellreschter goufen duerch Zentrifugatioun ewechgeholl. Start d'Reaktioun andeems Enzym oder Tissueextrakt zu engem Reaktiounspuffer bäigefüügt gëtt, deen 2,5 mg ml-1 pNPP enthält. D'Reaktiounsmëschung gouf bei Raumtemperatur am Däischteren inkubéiert, an d'Quantitéit u pNP, déi aus pNPP ëmgewandelt gouf, gouf quantifizéiert andeems d'Absorptioun bei 405 nm zu verschiddenen Zäiten gemooss gouf.
Fir d'in vitro EcK Aktivitéit gouf d'Protein mat 0,2 mg 20E oder 3D20E an 200 µl Puffer (pH 7,5) mat 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP an 10 mM MgCl2 fir 2 Stonnen bei 27 °C inkubéiert. D'Reaktioun gouf duerch d'Zousätz vun 800 µl Methanol gestoppt, duerno fir 1 Stonn bei -20 °C ofgekillt an duerno fir 10 Minutten bei 20.000 g bei 4 °C zentrifugéiert. Den Iwwerstand gouf duerno duerch HPLC-MS/MS analyséiert. Fir d'Proteinen, déi an der Kontrollgrupp benotzt goufen, duerch Hëtztinaktivéierung ze maachen, goufen d'Proteinen 20 Minutten bei 95 °C a 50% Glycerol a PBS inkubéiert.
Fir d'In-vitro-EPP-Aktivitéit gouf d'Protein mat 3D20E22P (gläichwäerteg mat der Quantitéit, déi an 18 MAG-Pairen fonnt gouf, gereinegt duerch HPLC-MS/MS) an 100 µl Puffer (pH 7,5) mat 25 mM Tris, 50 mM Essigsäure, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA an 1 mM DTT fir 3 Stonnen bei 27 °C inkubéiert. D'Reaktioun gouf duerch d'Zousätz vu 400 µl Methanol gestoppt an 1 Stonn bei -20 °C ofgekillt, duerno 10 Minutte bei 20.000 g bei 4 °C zentrifugéiert. Den Iwwerstand gouf duerch HPLC-MS/MS analyséiert.
PCR-Fragmenter fir EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) an EcK2 (556 bp) goufen aus cDNA amplifizéiert, déi aus Läiche vu kapplosen Moustiquen vu gemëschte Geschlechter preparéiert gouf. De PCR-Fragment vun der eGFP-Kontroll (495 bp) gouf aus dem virdru beschriwwenen pCR2.1-eGFP amplifizéiert; PCR-Primer sinn an der erweiderter Datentabell 2 opgezielt. De PCR-Fragment gouf tëscht den invertéierten T7-Promoteren um pL4440-Plasmid agefouert. Plasmidkonstrukter goufen aus NEB 5-α kompetenten E. coli (New England Biolabs) gewonnen a virum Gebrauch duerch DNA-Sequenzéierung verifizéiert (kuckt Ergänzungsdaten 1 fir d'Insertsequenz). Primer, déi mam T7-Promoter (erweidert Datentabell 2) iwwereneestëmmen, goufen benotzt fir den Insert vum pL4440-baséierte Plasmid ze amplifizéieren. D'Gréisst vum PCR-Produkt gouf duerch Agarosegelelektrophorese bestätegt. dsRNA gouf aus PCR-Templates mat dem Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) transkribéiert a no den Instruktioune vum Hiersteller mat de Modifikatioune gereinegt, déi virdru beschriwwe goufen.
Fir d'dsRNA-Injektioun goufen 1.380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) mat enger Konzentratioun vun 10 ng nl-1 an den Thorax vun erwuessene Männercher oder Weibchen (Nanoject III, Drummond) bannent 1 Dag no der Eclosion injizéiert. Gen-Knockdown-Niveauen goufen an op d'mannst dräi biologesche Replikater duerch RNA-Extraktioun, cDNA-Synthese an RT-qPCR bestëmmt. Fir d'Ecdyson-Injektioun goufen 4 Deeg al jonk oder 6 Deeg al jonk blutgefüttert Weibchen mat 0,13, 0,21 oder 0,63 µg 20E oder 3D20E (Nanoject III, Drummond) a Konzentratioune vun 1,3, 2,1 respektiv, ofhängeg vum experimentellen Design, oder 6,3 ng nl-1 injizéiert. Injizéiert 100 nl 10% (vol/vol) Ethanol a Waasser; 100 nl vun 3D20E22P an 10% Ethanol (entsprécht 75% vun der Quantitéit, déi an engem Paar MAGs fonnt gëtt). D'Moskitoen goufen zoufälleg an d'Injektiounsgrupp zougewisen.
Fir Laichtester goufen 3 Deeg al Weibercher ad libitum mat mënschlechem Blutt gefiddert. Deelweis gefiddert oder net gefiddert Moustiquen goufen ewechgeholl. Ofhängeg vun der Behandlung goufen d'Weibercher fir véier Nuechten op d'mannst 48 Stonnen nom Bluttmoolzecht a separat Laichbecher geluecht. D'Eeër goufen ënner engem Stereoskop (Stemi 508, Zeiss) gezielt; fir gepaart Weibercher goufen Eeër, aus deenen Larven ausgeschluppt goufen, als fruchtbar ugesinn.
Fir Paarungsversich kruten d'Weibchen, ofhängeg vun der Behandlung, op d'mannst 2 Deeg Zäit fir Resistenz géint d'Paarung z'entwéckelen, an d'Männchen vum Wildtyp am selwechten Alter goufen duerno an deeselwechte Käfeg agefouert. Zwee Nuechte méi spéit goufen déi befruchtete Vesikelen vun de Weibchen dissekéiert an d'genomesch DNA gouf duerch Afréieren-Optauen a Sonikéierung an engem Puffer mat 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA an 25 mM NaCl (pH 8,2) fräigesat. D'Prouwen goufen 15 Minutte bei 55 °C mat Proteinase K (0,86 µg µl-1) inkubéiert, gefollegt vun 10 Minutte bei 95 °C. Réi genomesch DNA-Preparatioune goufen 10-fach verdënnt an der qPCR-Detektioun vun Y-Chromosomsequenzen ënnerworf; Primer sinn an der erweiderter Datentabell 2 opgezielt. D'Feele vun enger Y-Chromosomsequenz weist keng Paarung un.
Fir Re-Paarungs-Tester goufen gezwongen-gepaarte Weibercher op d'Präsenz vu Paarungsstecker ënnersicht, fir de Paarungsstatus ze bestätegen, an et gouf 2 Deeg Zäit gelooss, fir eng Refraktäritéit fir d'Paarung z'entwéckelen, wann et keng Männchen gouf, wéi virdru beschriwwen36. Männchen, déi DsRed transgen Spermien droen, goufen dann a Weibercherkäfeg agefouert. Zwee Nuechte méi spéit goufen d'Befruchtungsvesikelen vun de Weibercher dissekéiert, an d'genomesch DNA gouf wéi uewe beschriwwen virbereet an enger qPCR-Detektioun vum DsRed Transgen ënnerworf; Primer sinn an der erweiderter Datentabell 2 opgezielt. D'Feele vum DsRed Transgen huet ugedeit, datt keng Re-Paarung stattfonnt huet.
3D20E gouf wéi virdru beschriwwen 37 synthetiséiert. Kuerz gesot, goufen 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) an 10 ml Waasser opgeléist, gefollegt vun den Zousätz vun 30 mg Platin-Schwaarz (a Pulverform, Sigma-Aldrich). E sanfte Stroum O2 gouf kontinuéierlech an d'Reaktiounsmëschung geblooselt, déi bei Raumtemperatur geréiert gouf. No 6 Stonnen goufen 30 ml Methanol bäigefüügt fir d'Reaktioun ze stoppen. D'Mëschung gouf zentrifugéiert fir Katalysatorpartikelen ze entfernen. Den Iwwerstand gouf bei Raumtemperatur am Vakuum bis zur Dréchent verdampft. Dat gedréchent Reaktiounsprodukt gouf an 10% Ethanol a Methanol fir d'Injektioun fir HPLC-MS/MS Analyse opgeléist. D'Ëmwandlungsquote (vun 20E op 3D20E) war ongeféier 97% (Fig. 4b), an den MS-Spektrum vum synthetiséierten 3D20E huet mat deem iwwereneegestëmmt, deen a gepaarte Weibchen fonnt gouf (Fig. 4c).
D'Legend enthält spezifesch Detailer vun den duerchgefouerte statisteschen Tester. GraphPad (Versioun 9.0) gouf benotzt fir den exakten Fisher-Test, de Mantel-Cox-Test an de Student-t-Test duerchzeféieren. Cochran-Mantel-Haenszel-Tester goufen mat engem personaliséierten R-Skript duerchgefouert (verfügbar op https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). D'Datenverdeelung gouf op Normalitéit mat dem Shapiro-Wilk-Test mat engem Signifikanzschwellwäert vun 0,05 getest. Wann d'Donnéeën den Normalitéitstest net bestanen hunn, gouf de Mann-Whitney-Test duerchgefouert. Iwwerliewensdaten goufen mam Mantel-Cox-Test analyséiert. Den DESeq2-Package (Versioun 1.28.1) gouf benotzt fir eng RNA-seq-Genniveau-Differenzialexpressionsanalyse duerchzeféieren. Déi horizontal Balk um Grafik representéiert de Median. E Signifikanzwäert vu P = 0,05 gouf als Schwellwäert fir all Tester benotzt.
Fir méi Informatiounen iwwer den Studiendesign, kuckt den Zesummefassung vum Nature Research Report, deen op dësen Artikel verlinkt ass.
MS-Proteomikdaten goufen iwwer de PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) mam Datesaz-Identifikator PXD032157 am ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) deposéiert.
Den RNA-seq-Datasaz ass an der Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ënner der Seriennummer GSE198665 deposéiert.
Zousätzlech Datensätz, déi während der aktueller Studie generéiert an/oder analyséiert goufen, kënnen op Ufro vun den entspriechenden Autoren kritt ginn. Dësen Artikel liwwert d'Quelldaten.
De Loof, A. Ecdysteroiden: Vernoléissegt Insektensexsteroiden? Männlech: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-Hydroxyecdyson an Eierstocksentwécklung bei Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).