Propionsäure (PPA), en Antimykotikum an e verbreeten Nahrungsergänzungsmittel, huet sech als Ursaach fir eng anormal Neuroentwécklung bei Mais erwisen, déi mat gastrointestinalen Dysfunktiounen begleet gëtt, déi duerch eng Darmdysbiose verursaacht kënne ginn. E Lien tëscht der PPA-Expositioun iwwer d'Ernährung an der Dysbiose vum Darmmikrobiota gouf scho virgeschloen, awer ass net direkt ënnersicht ginn. Hei hu mir PPA-assoziéiert Verännerungen an der Zesummesetzung vum Darmmikrobiota ënnersicht, déi zu enger Dysbiose féiere kënnen. Darmmikrobiome vu Mais, déi eng onbehandelt Ernährung (n=9) an eng PPA-angereichert Ernährung (n=13) kruten, goufen mat Hëllef vu laangfristeger metagenomescher Sequenzéierung sequenzéiert, fir Ënnerscheeder an der mikrobieller Zesummesetzung a bakteriellen Metabolismusweeër ze evaluéieren. PPA iwwer d'Ernährung war mat enger Erhéijung vun der Heefegkeet vu bedeitende Taxa assoziéiert, dorënner verschidde Bacteroides-, Prevotella- a Ruminococcus-Aarten, vun deenen d'Membere virdru schonn an der PPA-Produktioun involvéiert waren. D'Mikrobiome vu Mais, déi PPA-exponéiert goufen, haten och méi Weeër, déi mam Lipidmetabolismus an der Steroidhormonbiosynthese zesummenhänken. Eis Resultater weisen datt PPA d'Darmmikrobiota an hir assoziéiert Metabolismusweeër verännere kann. Dës observéiert Ännerungen ënnersträichen, datt Konservéierungsmëttel, déi als sécher fir de Konsum klasséiert sinn, d'Zesummesetzung vun der Darmflora an domat d'mënschlech Gesondheet beaflosse kënnen.
De mënschleche Mikrobiom gëtt dacks als "dat lescht Organ vum Kierper" bezeechent a spillt eng wichteg Roll fir d'Gesondheet vum Mënsch (Baquero an Nombela, 2012). Besonnesch de Darmmikrobiom ass fir säin systemwäiten Afloss a Roll a ville wesentleche Funktiounen unerkannt. Kommensal Bakterien sinn am Darm reichlech, besetzen verschidde ökologesch Nischen, notzen Nährstoffer a konkurréiere mat potenziellen Pathogenen (Jandhyala et al., 2015). Verschidde bakteriell Komponenten vun der Darmmikrobiota si fäeg, essentiell Nährstoffer wéi Vitaminnen ze produzéieren an d'Verdauung ze fërderen (Rowland et al., 2018). Bakterienmetabolitte goufen och gewisen, datt se d'Gewebeentwécklung beaflossen an de metaboleschen an immunologesche Wee verbesseren (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). D'Zesummesetzung vum mënschleche Darmmikrobiom ass extrem divers an hänkt vu geneteschen an Ëmweltfaktoren of, wéi Ernährung, Geschlecht, Medikamenter a Gesondheetszoustand (Kumbhare et al., 2019).
D'Ernährung vun der Mamm ass e wichtege Bestanddeel vun der Entwécklung vum Fetus an dem Neigebuerenen an eng méiglech Quell vu Verbindungen, déi d'Entwécklung beaflosse kënnen (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Eng sou eng interessant Verbindung ass Propionsäure (PPA), e kuerzketteg Fettsäure-Nebenprodukt, dat duerch bakteriell Fermentatioun gewonnen gëtt an e Liewensmëtteladditiv ass (den Besten et al., 2013). PPA huet antibakteriell an antifungal Eegeschaften a gëtt dofir als Liewensmëttelkonservéierungsmëttel a fir industriell Uwendungen benotzt, fir Schimmel a Bakterienwuesstum ze hemmen (Wemmenhove et al., 2016). PPA huet ënnerschiddlech Effekter a verschiddene Gewëss. An der Liewer huet PPA entzündungshemmend Effekter, andeems et d'Zytokinexpression a Makrophagen beaflosst (Kawasoe et al., 2022). Dësen regulatoreschen Effekt gouf och an aneren Immunzellen observéiert, wat zu enger Downreguléierung vun der Entzündung féiert (Haase et al., 2021). Wéi och ëmmer, de Géigendeel Effekt gouf am Gehir observéiert. Fréier Studien hunn gewisen, datt d'Beliichtung u PPA autismusähnlecht Verhalen bei Mais induzéiert (El-Ansary et al., 2012). Aner Studien hunn gewisen, datt PPA Gliose ausléise kann an pro-inflammatoresch Weeër am Gehir aktivéiere kann (Abdelli et al., 2019). Well PPA eng schwaach Säure ass, kann se sech duerch den Darmepithel an de Bluttkreeslaf diffundéieren an doduerch restriktiv Barrièren, dorënner d'Blutt-Hirn-Barrière souwéi d'Plazenta, iwwerwannen (Stinson et al., 2019), wat d'Wichtegkeet vu PPA als regulatoresche Metabolit, dee vu Bakterien produzéiert gëtt, ënnersträicht. Och wann déi potenziell Roll vu PPA als Risikofaktor fir Autismus de Moment ënnersicht gëtt, kéinten seng Auswierkungen op Persoune mat Autismus iwwer d'Induktioun vun neuronalen Differenzéierung erausgoen.
Gastrointestinal Symptomer wéi Duerchfall a Verstopfung si bei Patienten mat neurologeschen Entwécklungsstéierungen heefeg (Cao et al., 2021). Fréier Studien hunn gewisen, datt de Mikrobiom vu Patienten mat Autismus-Spektrum-Stéierungen (ASS) sech vun deem vu gesonde Persounen ënnerscheet, wat op d'Präsenz vun enger Dysbiose vun der Darm-Mikrobiota hiweist (Finegold et al., 2010). Ähnlech ënnerscheede sech d'Charakteristike vum Mikrobiom vu Patienten mat entzündleche Darmkrankheeten, Iwwergewiicht, Alzheimer, etc. och vun deene vu gesonde Persounen (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Bis elo gouf awer kee kausale Zesummenhang tëscht dem Darm-Mikrobiom an neurologesche Krankheeten oder Symptomer etabléiert (Yap et al., 2021), obwuel ugeholl gëtt, datt verschidde Bakterienaarten eng Roll bei e puer vun dëse Krankheetszoustänn spillen. Zum Beispill sinn Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio an aner Gattungen méi heefeg an der Mikrobiota vu Patienten mat Autismus (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Besonnesch ass et ze bemierken, datt Memberarten vun e puer vun dëse Gattungen Genen hunn, déi mat der PPA-Produktioun verbonne sinn (Reichardt et al., 2014; Yun a Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur an Dürre, 2023). Wéinst den antimikrobiellen Eegeschafte vu PPA kann eng Erhéijung vu senger Heefegkeet virdeelhaft fir de Wuesstum vu PPA-produzéierende Bakterien sinn (Jacobson et al., 2018). Dofir kann eng PFA-räich Ëmwelt zu Verännerungen an der Darm-Mikrobiota féieren, dorënner gastrointestinal Pathogenen, déi potenziell Faktoren kënne sinn, déi zu gastrointestinale Symptomer féieren.
Eng zentral Fro an der Mikrobiomfuerschung ass, ob Ënnerscheeder an der mikrobieller Zesummesetzung eng Ursaach oder e Symptom vun zugronnleeënde Krankheeten sinn. Den éischte Schrëtt fir déi komplex Bezéiung tëscht der Ernährung, dem Darmmikrobiom an neurologesche Krankheeten opzeklären ass d'Auswierkunge vun der Ernährung op d'mikrobiell Zesummesetzung ze evaluéieren. Zu dësem Zweck hu mir laangfristeg metagenomesch Sequenzéierung benotzt fir d'Darmmikrobiom vun den Nokommen vu Mais ze vergläichen, déi eng PPA-räich oder PPA-arm Ernährung kritt hunn. D'Nokommen kruten déiselwecht Ernährung wéi hir Mammen. Mir hunn d'Hypothes opgestallt, datt eng PPA-räich Ernährung zu Verännerungen an der Darmmikrobieller Zesummesetzung a mikrobiellen funktionelle Weeër féiere géif, besonnesch déi, déi mam PPA-Metabolismus an/oder der PPA-Produktioun zesummenhänken.
Dës Studie huet FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J transgen Mais (Jackson Laboratories) benotzt, déi gréngt fluoreszéierend Protein (GFP) ënner der Kontroll vum glia-spezifesche GFAP-Promoter iwwerexpriméieren, no de Richtlinne vum University of Central Florida Institutional Animal Care and Use Committee (UCF-IACUC) (Animal Use Permit Number: PROTO202000002). Nom Entwöhnen goufen d'Mais eenzel a Käfeg mat 1-5 Mais vun all Geschlecht pro Käfeg ënnerbruecht. D'Mais goufen ad libitum entweder mat enger gereinegter Kontrolldiät (modifizéiert Open-Label Standarddiät, 16 kcal% Fett) oder enger mat Natriumpropionat ergänzter Diät (modifizéiert Open-Label Standarddiät, 16 kcal% Fett, mat 5.000 ppm Natriumpropionat) gefiddert. D'Quantitéit u Natriumpropionat, déi benotzt gouf, entsprécht 5.000 mg PFA/kg Gesamtgewiicht vum Liewensmëttel. Dëst ass déi héchst Konzentratioun vu PPA, déi fir d'Benotzung als Liewensmëttelkonservéierungsmëttel zougelooss ass. Fir dës Studie virzebereeden, goufen d'Elteremais 4 Wochen virun der Paarung béid Diäten gefiddert, an dat während der ganzer Schwangerschaft vun der Mamm weidergefouert. D'Nokommenmais [22 Mais, 9 Kontrollmais (6 Männchen, 3 Weibchen) an 13 PPA (4 Männchen, 9 Weibchen)] goufen ofgewöhnt an duerno 5 Méint laang déiselwecht Diät wéi d'Mammen kritt. D'Nokommenmais goufen am Alter vu 5 Méint geaffert an hiren intestinalen Kot gouf gesammelt an ufanks a 1,5 ml Mikrozentrifugenréier bei -20°C gelagert an duerno an e Gefrierschrank bei -80°C transferéiert, bis d'DNA vum Wirt opgebraucht war an d'mikrobiell Nukleinsäuren extrahéiert goufen.
D'DNA vum Wirt gouf no engem modifizéierte Protokoll (Charalampous et al., 2019) ewechgeholl. Kuerz gesot, gouf den Inhalt vum Kot op 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) transferéiert a gefruer gelagert. Maximal 1-2 Kotpellets pro Extraktioun veraarbecht. Den Inhalt vum Kot gouf dann mechanesch mat engem Plastikpistel am Réier homogeniséiert, fir eng Schlamm ze bilden. Zentrifugéiert d'Prouwen 5 Minutten bei 10.000 RCF oder bis d'Prouwen pelletéiert sinn, da saugt den Iwwerstand of a resuspendéiert de Pellet an 250 µl 1× PBS. Füügt 250 µl 4,4% Saponinléisung (TCI, Produktnummer S0019) als Detergent zu der Prouf bäi, fir d'Membranen vun eukaryoteschen Zellen ze léisen. D'Prouwen goufen sanft bis glat gemëscht an 10 Minutten bei Raumtemperatur inkubéiert. Duerno, fir eukaryotesch Zellen ze zerstéieren, goufen 350 μl nukleasefräit Waasser an d'Prouf bäigefüügt, déi 30 Sekonnen inkubéiert gouf, an duerno goufen 12 μl 5 M NaCl bäigefüügt. D'Prouwe goufen dann 5 Minutte bei 6000 RCF zentrifugéiert. Den Iwwerstand aspiréiert an de Pellet an 100 μl 1X PBS resuspendéiert. Fir d'Wirt-DNA ze entfernen, ginn 100 μl HL-SAN Puffer (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml nukleasefräit Waasser) an 10 μl HL-SAN Enzym (ArticZymes P/N 70910-202) bäigefüügt. D'Prouwen goufen grëndlech duerch Pipettéierung gemëscht an 30 Minutte bei 37 °C mat 800 rpm op engem Eppendorf™ ThermoMixer C inkubéiert. Nom Inkubatioun gouf d'Pellet 3 Minutte bei 6000 RCF zentrifugéiert an zweemol mat 800 µl an 1000 µl 1X PBS gewäsch. Schlussendlech gouf de Pellet an 100 µl 1X PBS resuspendéiert.
Total bakteriell DNA gouf mat dem New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L) isoléiert. Déi Standardbetriebsprozedur, déi mam Kit geliwwert gëtt, ass liicht modifizéiert. Inkubéiert a behält nukleasefräit Waasser bei 60°C virum Operatioun fir déi lescht Elutioun. Füügt 10 µl Proteinase K an 3 µl RNase A zu all Prouf bäi. Dann füügt 100 µl Cell Lysis Buffer bäi a vermëscht virsiichteg. D'Prouwen goufen dann an engem Eppendorf™ ThermoMixer C bei 56°C an 1400 rpm fir op d'mannst 1 Stonn an bis zu 3 Stonnen inkubéiert. Déi inkubéiert Prouwen goufen 3 Minutten bei 12.000 RCF zentrifugéiert an den Iwwerstand vun all Prouf gouf an e separat 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mat 400 µL Bindungsléisung transferéiert. D'Réier goufen dann 5-10 Sekonnen an Intervalle vun 1 Sekonn pulséiert gevortext. Transferéiert den gesamte flëssegen Inhalt vun all Prouf (ongeféier 600–700 µL) an eng Filterpatroun, déi an engem Duerchfluss-Sammelröhrchen placéiert ass. D'Réier goufen 3 Minutten bei 1.000 RCF zentrifugéiert, fir eng initial DNA-Bindung z'erméiglechen, an duerno 1 Minutt bei 12.000 RCF zentrifugéiert, fir Reschtflëssegkeet ze entfernen. D'Proufkolonn gouf an en neit Sammelröhrchen transferéiert an duerno zweemol gewäsch. Fir déi éischt Wäschung, gitt 500 µL Wäschpuffer an all Réier. Dréit d'Réier 3–5 Mol ëm an zentrifugéiert dann 1 Minutt bei 12.000 RCF. Gidd d'Flëssegkeet aus dem Sammelröhrchen ewech a setzt d'Filterpatroun zeréck an datselwecht Sammelröhrchen. Fir déi zweet Wäschung, gitt 500 µL Wäschpuffer an de Filter, ouni se ëmzedréinen. D'Prouwen goufen 1 Minutt bei 12.000 RCF zentrifugéiert. Transferéiert de Filter an en 1,5 mL LoBind®-Réier a gitt 100 µL virgewärmt nukleasefräit Waasser derbäi. D'Filter goufen 1 Minutt bei Raumtemperatur inkubéiert an duerno 1 Minutt bei 12.000 RCF zentrifugéiert. Déi eluéiert DNA gouf bei -80°C gelagert.
D'DNA-Konzentratioun gouf mat engem Qubit™ 4.0 Fluorometer quantifizéiert. D'DNA gouf mat dem Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (Kat. Nr. Q33231) no den Instruktioune vum Hiersteller preparéiert. D'Längteverdeelung vun den DNA-Fragmenter gouf mat enger Aglient™ 4150 oder 4200 TapeStation gemooss. D'DNA gouf mat Agilent™ Genomic DNA Reagents (Kat. Nr. 5067-5366) a Genomic DNA ScreenTape (Kat. Nr. 5067-5365) preparéiert. D'Bibliothéiksvirbereedung gouf mat dem Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) no den Instruktioune vum Hiersteller duerchgefouert. D'DNA gouf mat engem ONT GridION™ Mk1 Sequenzer mat enger Min106D Flowzell (R 9.4.1) sequenzéiert. D'Sequenziéierungsastellungen waren: héichgenaueg Basisbezeechnung, minimale q-Wäert vun 9, Barcode-Astellung an Barcode-Trim. D'Prouwen goufen 72 Stonnen laang sequenzéiert, duerno goufen d'Basisdaten fir weider Veraarbechtung an Analyse geschéckt.
D'Bioinformatikveraarbechtung gouf mat virdru beschriwwene Methoden duerchgefouert (Greenman et al., 2024). D'FASTQ-Dateien, déi duerch d'Sequenzéierung kritt goufen, goufen fir all Prouf a Verzeichnisser opgedeelt. Virun der bioinformatescher Analyse goufen d'Donnéeën iwwer déi folgend Pipeline veraarbecht: als éischt goufen d'FASTQ-Dateie vun de Prouwe zu enger eenzeger FASTQ-Datei zesummegefaasst. Duerno goufen Liesungen, déi méi kuerz wéi 1000 bp waren, mat Filtlong v. 0.2.1 gefiltert, woubäi den eenzege geännerte Parameter –min_length 1000 war (Wick, 2024). Virun der weiderer Filterung gouf d'Liesqualitéit mat NanoPlot v. 1.41.3 mat de folgende Parameteren kontrolléiert: –fastq –plots dot –N50 -o(De Coster a Rademakers, 2023). D'Liesungen goufen mam Mausreferenzgenom GRCm39 (GCF_000001635.27) ofgestëmmt andeems minimap2 v. 2.24-r1122 benotzt gouf, fir vum Wirt kontaminéiert Liesungen mat de folgende Parameteren ze entfernen: -L -ax map-ont(Lee, 2018). Déi generéiert Alignmentdateien goufen an de BAM-Format mat samtools view -b (Danecek et al., 2021) a samtools v. 1.16.1 konvertéiert. Net-ausgeriicht Liesungen goufen dann mat samtools view -b -f 4 identifizéiert, wat drop hiweist, datt dës Liesungen net zum Hostgenom gehéiert hunn. Net-ausgeriicht Liesungen goufen mat samtools bam2fq mat Standardparameteren zréck an de FASTQ-Format konvertéiert. NanoPlot gouf op de weidere gefilterte Liesungen mat den Astellungen, déi virdru beschriwwe goufen, nei duerchgefouert. Nom Filteren goufen metagenomesch Donnéeën mat metaflye v. 2.8.2-b1689 mat de folgende Parameteren zesummegestallt: –nano-raw–meta (Kolmogorov et al., 2020). Loosst déi reschtlech Parameteren op hiren Standardwäerter. Nom Assembléiere goufen gefiltert Liesungen mat Hëllef vu minimap2 op d'Assembléiere gemappt, an de Parameter -ax map-ont gouf benotzt fir eng Ausriichtungsdatei am SAM-Format ze generéieren. D'Assembléiere gouf fir d'éischt mat racon v. 1.4.20 mat de folgende Parameteren verfeinert: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser et al., 2017). Nodeems racon fäerdeg war, gouf se weider mat medaka v. 1.7.2 verfeinert, mat medaka_consesus, woubäi all Parameteren ausser dem Parameter -m op hiren Standardwäerter gelooss goufen. De Parameter -m gëtt op r941_min_hac_g507 gesat fir d'Flosszellchemie an d'héichgenau Basisberuffung ze spezifizéieren, déi fir eis Donnéeën benotzt ginn (nanoporetech/medaka, 2024). Déi gefiltert Donnéeën (am weidere weider als mikrobiell Donnéeën bezeechent) an déi final gereinegt Assembléiere goufen fir déi spéider Analyse benotzt.
Fir d'taxonomesch Klassifikatioun goufen d'Liesungen an d'assembleiert Contigs mat Kraken2 v. 2.1.2 klasséiert (Wood et al., 2019). Generéiert Rapporten an Outputdateien fir Liesungen respektiv Assembler. Benotzt d'Optioun -use-names fir Liesungen an Assembler ze analyséieren. D'Optiounen -gzip-compressed an -paired sinn fir Liessegmenter spezifizéiert. Déi relativ Heefegkeet vun Taxa a Metagenomen gouf mat Bracken v. 2.8 geschat (Lu et al., 2017). Mir hunn als éischt eng kmer-Datebank mat 1000 Basen mat bracken-build mat de folgende Parameteren erstallt: -d-k 35 -l 1000 Soubal et gebaut ass, leeft Bracken op Basis vum Rapport, deen vum kraken2 generéiert gouf, a filtert d'Donnéeën mat de folgende Optiounen: -d -I -O-p 1000 -l

Dorënner gëtt P, G oder S ausgewielt, ofhängeg vum Klassifikatiounsniveau, deen analyséiert gëtt. Fir den Impakt vu falsch-positiven Klassifikatiounen ze minimiséieren, gouf e minimale relative Heefegkeetsschwellwäert vun 1e-4 (1/10.000 Liesungen) ugeholl. Virun der statistescher Analyse goufen déi relativ Heefegkeeten, déi vum Bracken gemellt goufen (fraction_total_reads), mat der centered log-ratio (CLR) Transformatioun transforméiert (Aitchison, 1982). D'CLR-Method gouf fir d'Datentransformatioun gewielt, well se skalainvariant ass a fir net-spuersam Datensätz ausreechend ass (Gloor et al., 2017). D'CLR-Transformatioun benotzt den natierleche Logarithmus. D'Zueldaten, déi vum Bracken gemellt goufen, goufen mat dem relative logarithmeschen Ausdrock (RLE) normaliséiert (Anders an Huber, 2010). D'Zuelen goufen mat enger Kombinatioun vu matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 a sequenziellen Logarithmen (Gloor et al., 2017) generéiert. 0.12.2 a Stantanotatiounen v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). De Bacillus/Bacteroidetes-Verhältnis gouf fir all Prouf mat normaliséierte Bakterienzuelen berechent. D'Wäerter, déi an den Tabellen uginn sinn, sinn op 4 Dezimalplazen ofgerënnt. De Simpson Diversitéitsindex gouf mat dem alpha_diversity.py Skript berechent, deen am KrakenTools v. 1.2 Package geliwwert gëtt (Lu et al., 2022). De Bracken-Bericht gëtt am Skript geliwwert an de Simpson-Index "Si" gëtt fir de -an Parameter geliwwert. Signifikant Ënnerscheeder an der Heefegkeet goufen definéiert als duerchschnëttlech CLR-Differenzen ≥ 1 oder ≤ -1. En duerchschnëttlechen CLR-Ënnerscheed vun ±1 weist eng 2,7-fache Erhéijung vun der Heefegkeet vun engem Prouftyp un. D'Zeechen (+/-) weist un, ob den Taxon méi heefeg an der PPA-Prouf respektiv der Kontrollprouf ass. D'Signifikanz gouf mam Mann-Whitney U-Test (Virtanen et al., 2020) festgestallt. Statsmodels v. 0.14 (Benjamini an Hochberg, 1995; Seabold a Perktold, 2010) gouf benotzt, an d'Benjamini-Hochberg-Prozedur gouf ugewannt fir Multiple Tester ze korrigéieren. En ugepassten p-Wäert ≤ 0.05 gouf als Schwellwäert fir d'Bestimmung vun der statistescher Signifikanz benotzt.
Genannotatioun a relativ Heefegkeetsschätzung goufen mat enger modifizéierter Versioun vum Protokoll vum Maranga et al. (Maranga et al., 2023) duerchgefouert. Als éischt goufen Contigs, déi méi kuerz wéi 500 bp waren, aus allen Assembléierungen mat SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016) ewechgeholl. Déi ausgewielten Assembléierungen goufen dann zu engem Pan-Metagenom kombinéiert. Open Reading Frames (ORFs) goufen mat Prodigal v. 1.0.1 (eng parallel Versioun vu Prodigal v. 2.6.3) mat de folgende Parameteren identifizéiert: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024). Déi resultéierend Nukleotiddateie goufen duerno mat Python gefiltert fir all onvollstänneg Genen ze läschen. CD-HIT v. 4.8.1 gouf duerno benotzt fir d'Genen mat de folgende Parameteren ze gruppéieren: cd-hit-est -i -O-c 0,95 -s 0,85 -aS 0,9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu et al., 2012). De generéierte net-redundante Genkatalog gouf benotzt fir d'Genhäufegkeet an d'Annotatioun ze schätzen. Déi relativ Genhäufegkeet gouf mat KMA v. 1.4.9 geschat (Clausen et al., 2018). Als éischt, erstellt eng Indexdatei mat dem KMA Index mat de folgende Parameteren: -i -ODann, andeems den Index zesumme mat de mikrobiellen Ofliesungen fir all Prouf generéiert gouf, wéi an der Sektioun Bioinformatik Pipeline beschriwwen, gouf KMA mat de folgende Parameteren duerchgefouert: -i -O-t_db-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. Duerno goufen d'Genzuelen mat CLR normaliséiert, an d'Principal Component Analysis (PCA) Klass vum Sci-kit learn gouf benotzt (Pedregosa et al., 2011). Déi virausgesot Genannotatioun gouf um net-redundante Genkatalog mat dem emapper.py Skript vun eggNOG v. 2.1.12 an der eggNOG Datebank Versioun 5.0.2 mat de folgende Parameteren duerchgefouert: –itype CDS –cpu 24 -i– Datenkatalog–go_evidence Net-elektronesch – Ausgab– Ausgabeverzeichnis–target_orthologs all –seed_ortholog_evalue 0.001 –seed_ortholog_score 60 –query_cover 20 –subject_cover 0 –translate –override –temp_dir(Cantalapiedra et al., 2021). D'KMA-Resultater goufen iwwerpréift fir Genen mat ausreechender Schablounenofdeckung an Schablounenidentitéit (≥ 90%) an Heefegkeet (Déift ≥ 3) ze wielen. D'KMA-Déifteresultater goufen mat CLR transforméiert, wéi uewe beschriwwen. D'KMA-Resultater goufen dann mat de Contig-IDs aus de funktionellen Annotatiouns- a Klassifikatiounsresultater verglach, andeems d'Contig-Quell fir all Gen benotzt gouf. Wéi bei den Taxa goufen signifikant Ënnerscheeder an der Genheefegkeet definéiert als Genen mat engem mëttleren CLR-Ënnerscheed ≥ 1 oder ≤ -1, mat engem Zeeche (+/-), dat ugeet, datt de Gen méi heefeg an de PPA- respektiv Kontrollproben war.
D'Genen goufen fir d'éischt no den Ortholog (KO) Identifizéierer vun der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) gruppéiert, déi vum eggNOG zougewisen goufen, fir d'Heefegkeet vun de Genweeër ze vergläichen. Genen ouni Knockouts oder Genen mat multiple Knockouts goufen virun der Analyse ewechgeholl. Déi duerchschnëttlech Heefegkeet vun all KO pro Prouf gouf duerno berechent an eng statistesch Analyse gouf duerchgefouert. PPA-Metabolismusgenen goufen als all Gen definéiert, deem eng Zeil ko00640 an der KEGG_Pathway Kolonn zougewisen gouf, wat op eng Roll am Propionatmetabolismus laut KEGG hiweist. Genen, déi als mat der PPA-Produktioun assoziéiert identifizéiert goufen, sinn an der Ergänzungstabell 1 opgezielt (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Permutatiounstester goufen duerchgefouert, fir PPA-Metabolismus- a Produktiounsgenen z'identifizéieren, déi an all Prouftyp signifikant méi heefeg waren. Dausend Permutatioune goufen fir all analyséiert Gen duerchgefouert. E p-Wäert vun 0,05 gouf als Ofgrenzung benotzt, fir d'statistesch Signifikanz ze bestëmmen. Funktional Annotatioune goufen eenzelne Genen an engem Cluster zougewisen, baséiert op den Annotatioune vu representativen Genen am Cluster. Taxa, déi mam PPA-Metabolismus an/oder der PPA-Produktioun assoziéiert sinn, konnten identifizéiert ginn, andeems Contig-IDen an den Kraken2-Outputdateien mat de selwechte Contig-IDen, déi während der funktioneller Annotatioun mat eggNOG bäibehale goufen, ofgestëmmt goufen. Signifikanztestunge goufen mam Mann-Whitney U-Test duerchgefouert, deen virdru beschriwwe gouf. D'Korrektioun fir multiple Tester gouf mat der Benjamini-Hochberg-Prozedur duerchgefouert. E p-Wäert vun ≤ 0,05 gouf als Ofgrenzung benotzt fir d'statistesch Signifikanz ze bestëmmen.
D'Diversitéit vum Darmmikrobiom vu Mais gouf mam Simpson Diversitéitsindex bewäert. Et goufen keng signifikant Ënnerscheeder tëscht de Kontroll- a PPA-Prouwen a punkto Gattung- a Speziesdiversitéit observéiert (p-Wäert fir Gattung: 0,18, p-Wäert fir Spezies: 0,16) (Figur 1). D'mikrobiell Zesummesetzung gouf duerno mat Hëllef vun der Haaptkomponentenanalyse (PCA) verglach. Figur 2 weist d'Clustering vu Prouwen no hire Phylen, wat drop hiweist, datt et Ënnerscheeder an der Spezieszesummesetzung vun de Mikrobiome tëscht de PPA- a Kontrollprouwen gouf. Dës Clustering war manner ausgeprägt op Gattungniveau, wat drop hiweist, datt PPA bestëmmt Bakterien beaflosst (Ergänzungsfigur 1).
Figur 1. Alpha-Diversitéit vu Gattungen an Aartekompositioun vum Maus-Darm-Mikrobiom. Boxdiagrammer, déi d'Simpson-Diversitéitsindizes vu Gattungen (A) an Aarten (B) a PPA- a Kontrollproben weisen. D'Signifikantkeet gouf mam Mann-Whitney U-Test bestëmmt, an d'Multiple-Korrektur gouf mat der Benjamini-Hochberg-Prozedur duerchgefouert. ns, p-Wäert war net signifikant (p>0,05).
Figur 2. Resultater vun der Haaptkomponentenanalyse vun der Zesummesetzung vum Darmmikrobiom am Maus op Aartsniveau. De Graf vun der Haaptkomponentenanalyse weist d'Verdeelung vun de Proben iwwer hir éischt zwou Haaptkomponenten. D'Faarwen uginn den Typ vun der Prouf: PPA-exponéiert Mais si violett a Kontrollmais si giel. D'Haaptkomponenten 1 an 2 sinn op der x-Achs respektiv der y-Achs duergestallt a ginn als hiren erkläerten Varianzverhältnis ausgedréckt.
Mat Hëllef vun RLE-transforméierten Zähldaten gouf eng signifikant Ofsenkung vum mediane Bacteroidetes/Bacilli-Verhältnis bei Kontroll- a PPA-Mais observéiert (Kontroll: 9,66, PPA: 3,02; p-Wäert = 0,0011). Dësen Ënnerscheed war op eng méi héich Heefegkeet vu Bacteroidetes bei PPA-Mais am Verglach zu Kontrollen zeréckzeféieren, obwuel den Ënnerscheed net signifikant war (Kontrollduerchschnëttlech CLR: 5,51, PPA Duerchschnëttlech CLR: 6,62; p-Wäert = 0,054), während d'Heefegkeet vu Bacteroidetes ähnlech war (Kontrollduerchschnëttlech CLR: 7,76, PPA Duerchschnëttlech CLR: 7,60; p-Wäert = 0,18).
D'Analyse vun der Heefegkeet vun den taxonomesche Memberen vum Darmmikrobiom huet gewisen, datt 1 Stamm an 77 Aarte sech tëscht PPA- a Kontrollprouwen signifikant ënnerscheet hunn (Zousätzlech Tabelle 2). D'Heefegkeet vu 59 Aarte a PPA-Prouwen war signifikant méi héich wéi a Kontrollprouwen, während d'Heefegkeet vu just 16 Aarte a Kontrollprouwen méi héich war wéi a PPA-Prouwen (Figur 3).
Figur 3. Differenziell Heefegkeet vun Taxa am Darmmikrobiom vu PPA- a Kontrollmais. Vulkandiagrammer weisen Ënnerscheeder an der Heefegkeet vu Gattungen (A) oder Aarten (B) tëscht PPA- a Kontrollprouwen. Gro Punkten weisen keen signifikanten Ënnerscheed an der Heefegkeet vun Taxa un. Faarweg Punkten weisen signifikant Ënnerscheeder an der Heefegkeet un (p-Wäert ≤ 0,05). Déi Top 20 Taxa mat de gréissten Ënnerscheeder an der Heefegkeet tëscht de Prouftypen sinn a rout a hellblo (Kontroll- a PPA-Prouwen) duergestallt. Giel a violett Punkten ware mindestens 2,7 Mol méi heefeg a Kontroll- oder PPA-Prouwen wéi a Kontrollen. Schwaarz Punkten representéieren Taxa mat signifikant ënnerschiddlechen Heefegkeeten, mat duerchschnëttleche CLR-Ënnerscheeder tëscht -1 an 1. P-Wäerter goufen mam Mann-Whitney U-Test berechent a fir multiple Tester mat der Benjamini-Hochberg-Prozedur korrigéiert. Fettgedréckte mëttler CLR-Ënnerscheeder weisen signifikant Ënnerscheeder an der Heefegkeet un.
Nodeems mir d'Zesummesetzung vun der Darmmikrobium analyséiert hunn, hu mir eng funktionell Annotatioun vum Mikrobiom duerchgefouert. Nodeems mir Genen vun niddereger Qualitéit erausgefiltert hunn, goufen insgesamt 378.355 eenzegaarteg Genen an alle Proben identifizéiert. Déi transforméiert Heefegkeet vun dëse Genen gouf fir d'Haaptkomponentanalyse (PCA) benotzt, an d'Resultater hunn en héije Grad u Gruppéierung vu Probentypen op Basis vun hire funktionelle Profiler gewisen (Figur 4).
Figur 4. PCA-Resultater mat Hëllef vum funktionelle Profil vum Darmmikrobiom vun der Maus. De PCA-Diagramm weist d'Verdeelung vun de Proben iwwer hir éischt zwou Haaptkomponenten. D'Faarwen uginn den Typ vun der Prouf: PPA-exponéiert Mais si violett a Kontrollmais si giel. D'Haaptkomponenten 1 an 2 sinn op der x-Achs respektiv der y-Achs duergestallt a ginn als hiren erkläerten Varianzverhältnis ausgedréckt.
Mir hunn duerno d'Heefegkeet vu KEGG-Knockouts an ënnerschiddleche Prouftypen ënnersicht. Insgesamt goufen 3648 eenzegaarteg Knockouts identifizéiert, vun deenen 196 däitlech méi heefeg a Kontrollprouwen an 106 méi heefeg a PPA-Prouwen waren (Figur 5). Insgesamt goufen 145 Genen a Kontrollprouwen an 61 Genen a PPA-Prouwen detektéiert, mat signifikant ënnerschiddlechen Heefegkeeten. Weeër am Zesummenhang mam Lipid- an Aminozuckermetabolismus waren däitlech méi angereichert a PPA-Prouwen (Ergänzungstabell 3). Weeër am Zesummenhang mam Stickstoffmetabolismus a Schwefelrelaissystemer waren däitlech méi angereichert a Kontrollprouwen (Ergänzungstabell 3). D'Heefegkeet vu Genen am Zesummenhang mam Aminozucker/Nukleotidmetabolismus (ko:K21279) an Inositolphosphatmetabolismus (ko:K07291) war däitlech méi héich a PPA-Prouwen (Figur 5). Kontrollprouwen haten däitlech méi Genen am Zesummenhang mam Benzoatmetabolismus (ko:K22270), Stickstoffmetabolismus (ko:K00368) a Glykolyse/Glukoneogenese (ko:K00131) (Figur 5).
Abb. 5. Differenziell Heefegkeet vu KOs am ​​Darmmikrobiom vu PPA- a Kontrollmais. De Vulkandiagramm weist d'Ënnerscheeder an der Heefegkeet vu funktionelle Gruppen (KOs). Gro Punkten weisen KOs un, deenen hir Heefegkeet net signifikant tëscht de Prouftypen ënnerschiddlech war (p-Wäert > 0,05). Faarweg Punkten weisen signifikant Ënnerscheeder an der Heefegkeet un (p-Wäert ≤ 0,05). Déi 20 KOs mat de gréissten Ënnerscheeder an der Heefegkeet tëscht de Prouftypen sinn a rout a hellblo duergestallt, wat de Kontroll- a PPA-Prouwen entsprécht. Giel a violett Punkten weisen KOs un, déi op d'mannst 2,7-mol méi heefeg a Kontroll- a PPA-Prouwen waren. Schwaarz Punkten weisen KOs mat signifikant ënnerschiddlechen Heefegkeeten un, mat duerchschnëttleche CLR-Ënnerscheeder tëscht -1 an 1. D'P-Wäerter goufen mam Mann-Whitney U-Test berechent a fir multiple Vergläicher mat der Benjamini-Hochberg-Prozedur ugepasst. NaN weist datt de KO net zu engem Wee am KEGG gehéiert. Fettgedréckte mëttler CLR-Ënnerscheedswäerter weisen signifikant Ënnerscheeder an der Heefegkeet un. Fir detailléiert Informatiounen iwwer d'Weeër, zu deenen déi opgezielt KOs gehéieren, kuckt d'Ergänzungstabell 3.
Ënnert den annotéierte Genen haten 1601 Genen signifikant ënnerschiddlech Heefegkeeten tëscht den Prouftypen (p ≤ 0,05), woubäi all Gen op d'mannst 2,7-mol méi heefeg war. Vun dëse Genen waren 4 Genen méi heefeg a Kontrollprouwen an 1597 Genen méi heefeg a PPA-Prouwen. Well PPA antimikrobiell Eegeschafte huet, hu mir d'Heefegkeete vu PPA-Metabolismus- a Produktiounsgenen tëscht den Prouftypen ënnersicht. Ënnert den 1332 PPA-Metabolismus-bezunnen Genen waren 27 Genen signifikant méi heefeg a Kontrollprouwen an 12 Genen méi heefeg a PPA-Prouwen. Ënnert den 223 PPA-Produktiouns-bezunnen Genen war 1 Gen signifikant méi heefeg a PPA-Prouwen. Figur 6A weist weider déi méi héich Heefegkeet vu Genen, déi am PPA-Metabolismus involvéiert sinn, mat enger signifikant méi héijer Heefegkeet a Kontrollprouwen a groussen Effektgréissten, während Figur 6B eenzel Genen mat enger signifikant méi héijer Heefegkeet ervirhiewt, déi a PPA-Prouwen observéiert gouf.
Fig. 6. Differenziell Heefegkeet vu PPA-verwandte Genen am Maus-Darm-Mikrobiom. Vulkandiagrammer weisen d'Ënnerscheeder an der Heefegkeet vu Genen, déi mam PPA-Metabolismus (A) an der PPA-Produktioun (B) assoziéiert sinn. Gro Punkten weisen Genen un, deenen hir Heefegkeet net signifikant tëscht de Prouftypen ënnerschiddlech war (p-Wäert > 0,05). Faarweg Punkten weisen signifikant Ënnerscheeder an der Heefegkeet un (p-Wäert ≤ 0,05). Déi 20 Genen mat de gréissten Ënnerscheeder an der Heefegkeet sinn a rout a hellblo (Kontroll- a PPA-Prouwen) gewisen. D'Heefegkeet vu gielen a violette Punkten war op d'mannst 2,7 Mol méi grouss a Kontroll- a PPA-Prouwen wéi a Kontrollprouwen. Schwaarz Punkten representéieren Genen mat signifikant ënnerschiddlechen Heefegkeeten, mat duerchschnëttleche CLR-Ënnerscheeder tëscht -1 an 1. P-Wäerter goufen mam Mann-Whitney U-Test berechent a fir multiple Vergläicher mat der Benjamini-Hochberg-Prozedur korrigéiert. Genen entspriechen representativen Genen am net-redundante Genkatalog. Gennimm bestinn aus dem KEGG-Symbol, dat e KO-Gen bezeechent. Fettgedréckte mëttler CLR-Ënnerscheeder weisen signifikant ënnerschiddlech Heefegkeeten un. En Stréch (-) weist un, datt et kee Symbol fir d'Gen an der KEGG-Datebank gëtt.
Taxa mat Genen, déi mam PPA-Metabolismus an/oder der PPA-Produktioun zesummenhänken, goufen identifizéiert andeems d'taxonomesch Identitéit vun de Contigs mat der Contig-ID vum Gen ofgestëmmt gouf. Op Gattungsniveau goufen 130 Gattungen mat Genen fonnt, déi mam PPA-Metabolismus zesummenhänken, an 61 Gattungen mat Genen, déi mat der PPA-Produktioun zesummenhänken (Zousätzlech Tabelle 4). Wéi och ëmmer, keng Gattung huet signifikant Ënnerscheeder an der Heefegkeet gewisen (p > 0,05).
Op Aartsniveau goufen 144 Bakterienaarten mat Genen fonnt, déi mam PPA-Metabolismus assoziéiert sinn, an 68 Bakterienaarten mat Genen, déi mat der PPA-Produktioun assoziéiert sinn (Zousätzlech Tabelle 5). Ënnert de PPA-Metaboliséierer hunn aacht Bakterien eng signifikant Erhéijung vun der Heefegkeet tëscht de Prouftypen gewisen, an all hunn signifikant Ännerungen am Effekt gewisen (Zousätzlech Tabelle 6). All identifizéiert PPA-Metaboliséierer mat signifikanten Ënnerscheeder an der Heefegkeet ware méi heefeg an de PPA-Prouwen. D'Klassifikatioun op Aartsniveau huet Vertrieder vu Gattungen opgedeckt, déi sech net signifikant tëscht de Prouftypen ënnerscheeden, dorënner verschidde Bacteroides- an Ruminococcus-Aarten, souwéi Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus an Alcaligenes polymorpha. Ënnert de PPA-produzéierende Bakterien hunn véier Bakterien signifikant Ënnerscheeder an der Heefegkeet tëscht de Prouftypen gewisen. Aarte mat signifikanten Ënnerscheeder an der Heefegkeet waren ënner anerem Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis a Ruminococcus bovis.
An dëser Studie hu mir d'Auswierkunge vun der PPA-Expositioun op d'Darmflora vu Mais ënnersicht. PPA kann ënnerschiddlech Reaktiounen a Bakterien ausléisen, well et vu bestëmmten Aarte produzéiert gëtt, vun anere Aarte als Nahrungsquell benotzt gëtt oder antimikrobiell Effekter huet. Dofir kann seng Zousaz an d'Darmëmfeld iwwer Nahrungsergänzungsmittel ënnerschiddlech Effekter hunn, ofhängeg vun der Toleranz, der Empfindlechkeet an der Fäegkeet, et als Nährstoffquell ze benotzen. Sensibel Bakterienaarten kënnen eliminéiert an duerch déi ersat ginn, déi méi resistent géint PPA sinn oder et als Nahrungsquell benotze kënnen, wat zu Verännerungen an der Zesummesetzung vun der Darmflora féiert. Eis Resultater hunn bedeitend Ënnerscheeder an der mikrobieller Zesummesetzung gewisen, awer keen Effekt op déi allgemeng mikrobiell Diversitéit. Déi gréisst Effekter goufen op Aartniveau observéiert, mat iwwer 70 Taxa, déi sech an der Heefegkeet tëscht PPA a Kontrollprouwen signifikant ënnerscheeden (Ergänzungstabell 2). Eng weider Evaluatioun vun der Zesummesetzung vu PPA-exponéierte Prouwen huet eng méi grouss Heterogenitéit vu mikrobiellen Aarte am Verglach mat net-exponéierte Prouwen opgedeckt, wat drop hiweist, datt PPA d'Bakterienwuesstumseigenschaften erhéije kann a Bakterienpopulatiounen limitéiere kann, déi an PPA-räichen Ëmfeld iwwerliewe kënnen. Dofir kann PPA selektiv Verännerungen induzéieren anstatt eng verbreet Stéierung vun der Darmflora-Diversitéit ze verursaachen.
Liewensmëttelkonservéierungsmëttel wéi PPA goufen virdru gewisen, datt se d'Heefegkeet vun de Komponenten vum Darm-Mikrobiom änneren, ouni d'Gesamtdiversitéit ze beaflossen (Nagpal et al., 2021). Hei hu mir déi opfällegst Ënnerscheeder tëscht Bacteroidetes-Aarten am Stamm Bacteroidetes (fréier bekannt als Bacteroidetes) observéiert, déi bei PPA-exponéierte Mais signifikant angereichert waren. Eng erhéicht Heefegkeet vu Bacteroides-Aarten ass mat enger erhéichter Schleimofbau verbonnen, wat de Risiko vun enger Infektioun erhéije kann an Entzündungen förderen kann (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Eng Studie huet festgestallt, datt nei gebuer männlech Mais, déi mat Bacteroides fragilis behandelt goufen, sozial Verhalensweisen gewisen hunn, déi un Autismus-Spektrum-Stéierungen (ASD) erënneren (Carmel et al., 2023), an aner Studien hunn gewisen, datt Bacteroides-Aarten d'Immunaktivitéit verännere kënnen a zu autoimmuner entzündlecher Kardiomyopathie féiere kënnen (Gil-Cruz et al., 2019). Aarte vun de Gattungen Ruminococcus, Prevotella a Parabacteroides waren och signifikant méi heefeg bei Mais, déi PPA ausgesat waren (Coretti et al., 2018). Bestëmmt Ruminococcus-Aarten si mat Krankheeten ewéi Morbus Crohn duerch d'Produktioun vu proinflammatoresche Zytokine verbonnen (Henke et al., 2019), während Prevotella-Aarten ewéi Prevotella humani mat Stoffwiesselkrankheeten ewéi Hypertonie an Insulinempfindlechkeet verbonne sinn (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Schlussendlech hu mir festgestallt, datt de Verhältnis vu Bacteroidetes (fréier bekannt als Firmicutes) zu Bacteroidetes bei PPA-ausgesate Mais signifikant méi niddreg war ewéi bei Kontrollmais, wéinst enger méi héijer Gesamthäufegkeet vu Bacteroidetes-Aarten. Dëst Verhältnis gouf virdru als e wichtegen Indikator fir d'Darmhomöostase gewisen, an Stéierunge vun dësem Verhältnis goufen mat verschiddene Krankheetszoustänn a Verbindung bruecht (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), dorënner entzündlech Darmkrankheeten (Stojanov et al., 2020). Zesummegefaasst schéngen Aarte vum Stamm Bacteroidetes am stäerksten vun engem erhéichte PPA an der Nahrung betraff ze sinn. Dëst kéint op eng méi héich Toleranz géint PPA oder d'Fäegkeet zréckzeféieren sinn, PPA als Energiequell ze benotzen, wat sech fir op d'mannst eng Aart, Hoylesella enocea, als wouer erwisen huet (Hitch et al., 2022). Alternativ kann d'Beliichtung vun der Mamm mat PPA d'Fetalentwécklung verbesseren, andeems den Darm vu Mais-Nokommen méi ufälleg fir d'Kolonisatioun vu Bacteroidetes mécht; eisen Studiendesign huet sou eng Bewäertung awer net erlaabt.
D'Bewäertung vum metagenomeschen Inhalt huet bedeitend Ënnerscheeder an der Heefegkeet vu Genen opgedeckt, déi mam PPA-Metabolismus a -produktioun verbonne sinn, woubäi Mais, déi dem PPA ausgesat waren, eng méi héich Heefegkeet vu Genen gewisen hunn, déi fir d'PPA-Produktioun verantwortlech sinn, während Mais, déi net dem PPA ausgesat waren, eng méi héich Heefegkeet vu Genen gewisen hunn, déi fir de PAA-Metabolismus verantwortlech sinn (Figur 6). Dës Resultater suggeréieren, datt den Effekt vum PPA op d'mikrobiell Zesummesetzung net eleng op seng Notzung zréckzeféieren ass, soss hätt d'Heefegkeet vu Genen, déi mam PPA-Metabolismus verbonne sinn, eng méi héich Heefegkeet am Darm-Mikrobiom vu Mais, déi dem PPA ausgesat waren, solle weisen. Eng Erklärung ass, datt PPA d'bakteriell Heefegkeet haaptsächlech duerch seng antimikrobiell Effekter vermittelt, anstatt duerch seng Notzung duerch Bakterien als Nährstoff. Fréier Studien hunn gewisen, datt PPA d'Wuesstum vu Salmonella Typhimurium op eng dosisofhängeg Manéier hemmt (Jacobson et al., 2018). D'Beliichtung mat méi héije Konzentratioune vu PPA kann Bakterien auswielen, déi resistent géint seng antimikrobiell Eegeschafte sinn a se net onbedéngt metaboliséiere oder produzéiere kënnen. Zum Beispill hunn e puer Parabacteroides-Aarten eng däitlech méi héich Heefegkeet a PPA-Prouwen gewisen, awer keng Genen, déi mam PPA-Metabolismus oder -Produktioun zesummenhänken, goufen nogewisen (Ergänzungstabellen 2, 4 an 5). Ausserdeem ass d'PPA-Produktioun als Fermentatiounsnebenprodukt wäit verbreet tëscht verschiddene Bakterien (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Eng méi héich bakteriell Diversitéit kéint de Grond fir déi méi héich Heefegkeet vu Genen sinn, déi mam PPA-Metabolismus a Kontrollprouwen zesummenhänken (Averina et al., 2020). Ausserdeem goufen nëmmen 27 (2,14%) vun 1332 Genen als Genen virausgesot, déi exklusiv mam PPA-Metabolismus zesummenhänken. Vill Genen, déi mam PPA-Metabolismus zesummenhänken, sinn och an anere metabolesche Weeër involvéiert. Dëst weist weider, datt d'Heefegkeet vu Genen, déi mam PPA-Metabolismus zesummenhänken, an de Kontrollprouwen méi héich war; dës Genen kënnen a Weeër funktionéieren, déi net zu enger PPA-Notzung oder -Bildung als Nebenprodukt féieren. An dësem Fall huet nëmmen ee Gen, deen mat der PPA-Generatioun zesummenhänken, signifikant Ënnerscheeder an der Heefegkeet tëscht de Prouftypen gewisen. Am Géigesaz zu Genen, déi mam PPA-Metabolismus zesummenhänken, goufen d'Markergenen fir d'PPA-Produktioun ausgewielt, well se direkt am bakterielle Wee fir d'PPA-Produktioun involvéiert sinn. Bei PPA-exponéierte Mais gouf festgestallt, datt all Aarte eng signifikant erhéicht Heefegkeet a Kapazitéit fir PPA ze produzéieren haten. Dëst ënnerstëtzt d'Prognose, datt PPAe PPA-Produzente géife selektéieren an dofir viraussoen, datt d'PPA-Produktiounskapazitéit géif eropgoen. D'Genheefegkeet korreléiert awer net onbedéngt mat der Genexpression; dofir, obwuel d'Heefegkeet vu Genen, déi mam PPA-Metabolismus assoziéiert sinn, a Kontrollprouwen méi héich ass, kann d'Expressiounsquote anescht sinn (Shi et al., 2014). Fir d'Bezéiung tëscht der Prävalenz vu PPA-produzéierende Genen an der PPA-Produktioun ze bestätegen, sinn Studien iwwer d'Expressioun vu Genen, déi an der PPA-Produktioun involvéiert sinn, néideg.
Funktional Annotatioun vun de PPA- a Kontroll-Metagenomen huet e puer Ënnerscheeder opgedeckt. D'PCA-Analyse vum Geninhalt huet diskret Cluster tëscht PPA- a Kontrollprouwen opgedeckt (Figur 5). Clustering bannent der Prouf huet opgedeckt, datt den Kontrollgeninhalt méi divers war, während PPA-Prouwen zesummegeclustert hunn. Clustering no Geninhalt war vergläichbar mat Clustering no Aartenzesummesetzung. Dofir sinn d'Ënnerscheeder an der Heefegkeet vun de Weeër konsequent mat Ännerungen an der Heefegkeet vu spezifeschen Aarten a Stämm bannent hinnen. An de PPA-Prouwen waren zwou Weeër mat enger däitlech méi héijer Heefegkeet mam Aminozucker/Nukleotid-Zockermetabolismus (ko:K21279) a multiple Lipidmetabolismusweeër (ko:K00647, ko:K03801; Ergänzungstabell 3) a Verbindung bruecht. Genen, déi mat ko:K21279 assoziéiert sinn, sinn bekanntlech mat der Gattung Bacteroides assoziéiert, eng vun de Gattungen mat enger däitlech méi héijer Zuel vun Aarten an de PPA-Prouwen. Dëst Enzym kann der Immunantwort ëmgoen andeems et kapsulär Polysacchariden expriméiert (Wang et al., 2008). Dëst kéint d'Erhéijung vu Bacteroidetes erklären, déi a PPA-exponéierte Mais observéiert gouf. Dëst ergänzt déi erhéicht Fettsäuresynthese, déi am PPA-Mikrobiom observéiert gouf. Bakterien benotzen de FASIIko:K00647 (fabB)-Signalwee fir Fettsäuren ze produzéieren, déi d'Stoffweeër vum Wirt beaflosse kënnen (Yao a Rock, 2015; Johnson et al., 2020), a Verännerungen am Lipidmetabolismus kéinten eng Roll an der Neuroentwécklung spillen (Yu et al., 2020). En anere Signalwee, deen eng erhéicht Heefegkeet a PPA-Prouwen weist, war d'Steroidhormonbiosynthese (ko:K12343). Et gëtt ëmmer méi Beweiser dofir, datt et eng invers Bezéiung tëscht der Fäegkeet vun der Darmflora gëtt, den Hormonspigel ze beaflossen, an duerch Hormonen beaflosst ze ginn, sou datt erhéicht Steroidniveauen no ënnen Konsequenze fir d'Gesondheet kënnen hunn (Tetel et al., 2018).
Dës Studie ass net ouni Aschränkungen a Bedenken. Eng wichteg Ënnerscheedung ass, datt mir keng physiologesch Bewäertunge vun den Déieren duerchgefouert hunn. Dofir ass et net méiglech direkt ze schléissen, ob Verännerungen am Mikrobiom mat iergendenger Krankheet verbonne sinn. Eng aner Iwwerleeung ass, datt d'Mais an dëser Studie déiselwecht Ernährung kruten wéi hir Mammen. Zukünfteg Studien kéinten erausfannen, ob de Wiessel vun enger PPA-räicher Ernährung op eng PPA-fräi Ernährung hir Auswierkungen op de Mikrobiom verbessert. Eng Aschränkung vun eiser Studie, wéi villen aneren, ass déi limitéiert Proufgréisst. Och wann valabel Conclusiounen gezunn kënne ginn, géif eng méi grouss Proufgréisst eng méi grouss statistesch Kraaft bei der Analyse vun de Resultater bidden. Mir si virsiichteg mat Conclusiounen iwwer eng Associatioun tëscht Verännerungen am Darmmikrobiom an iergendenger Krankheet (Yap et al., 2021). Stéierend Faktoren, dorënner Alter, Geschlecht an Ernährung, kënnen d'Zesummesetzung vu Mikroorganismen wesentlech beaflossen. Dës Faktoren kéinten d'Inkonsequenzen erklären, déi an der Literatur iwwer d'Associatioun vum Darmmikrobiom mat komplexe Krankheeten observéiert goufen (Johnson et al., 2019; Lagod a Naser, 2023). Zum Beispill gouf gewisen, datt Membere vum Genus Bacteroidetes entweder méi oder manner dacks bei Déieren a Mënschen mat Autismus (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017) optrieden. Ähnlech hunn Studien iwwer d'Darmzesummesetzung bei Patienten mat entzündleche Darmerkrankungen souwuel Erhéijungen wéi och Réckgäng an deene selwechte Taxa festgestallt (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Fir den Impakt vum Geschlechterbias ze limitéieren, hu mir probéiert eng gläichberechtegt Representatioun vun de Geschlechter ze garantéieren, sou datt d'Ënnerscheeder héchstwahrscheinlech duerch d'Ernährung verursaacht goufen. Eng Erausfuerderung vun der funktioneller Annotatioun ass d'Entfernung vu redundante Gensequenzen. Eis Genclustering-Method erfuerdert eng Sequenzidentitéit vun 95% an eng Längtähnlechkeet vun 85%, souwéi eng Ofdeckung vun der Ausriichtung vun 90%, fir falsch Clustering ze eliminéieren. Wéi och ëmmer, a verschiddene Fäll hu mir COGs mat deene selwechten Annotatiounen observéiert (z.B. MUT) (Fig. 6). Weider Studien sinn néideg fir festzestellen, ob dës Orthologen ënnerschiddlech sinn, mat spezifesche Gattungen assoziéiert sinn, oder ob dëst eng Limitatioun vum Genclustering-Usaz ass. Eng aner Limitatioun vun der funktioneller Annotatioun ass eng potenziell Fehlklassifikatioun; de bakteriellen Gen mmdA ass e bekannten Enzym, deen an der Propionatsynthese involvéiert ass, awer KEGG assoziéiert et net mam Propionat-Metabolismuswee. Am Géigesaz dozou sinn d'Orthologen scpB an mmcD verwandt. Déi grouss Zuel vu Genen ouni designéiert Knockouts kann dozou féieren, datt PPA-verbonne Genen net identifizéiere kënnen, wann d'Genhäufegkeet bewäert gëtt. Zukünfteg Studien profitéiere vun der Metatranskriptomanalyse, déi e méi déift Verständnis vun de funktionelle Charakteristike vun der Darm-Mikrobiota ka bidden an d'Genexpression mat potenziellen Downstream-Effekter a Verbindung brénge kann. Fir Studien, déi spezifesch neurologesch Entwécklungsstéierungen oder entzündlech Darmkrankheeten involvéieren, sinn physiologesch a verhalensméisseg Bewäertunge vun Déieren néideg, fir Ännerungen an der Zesummesetzung vum Mikrobiom mat dëse Stéierungen a Verbindung ze bréngen. Weider Studien, déi den Darm-Mikrobiom a keimfräi Mais transplantéieren, wieren och nëtzlech fir festzestellen, ob de Mikrobiom en Treiber oder Charakteristik vun der Krankheet ass.
Zesummefaassend hu mir gewisen, datt PPA an der Ernährung e Faktor bei der Ännerung vun der Zesummesetzung vun der Darmflora ass. PPA ass e vun der FDA zougeloossene Konservéierungsmëttel, dat wäit verbreet a verschiddene Liewensmëttel fonnt gëtt a bei längerer Belaaschtung zu enger Stéierung vun der normaler Darmflora féiere kann. Mir hunn Ännerungen an der Heefegkeet vu verschiddene Bakterien festgestallt, wat drop hiweist, datt PPA d'Zesummesetzung vun der Darmflora beaflosse kann. Ännerungen an der Darmflora kënnen zu Ännerungen an de Niveaue vu bestëmmte metabolesche Weeër féieren, wat zu physiologesche Verännerungen féiere kann, déi relevant fir d'Gesondheet vum Wirt sinn. Weider Studien sinn néideg fir festzestellen, ob d'Auswierkunge vun PPA an der Ernährung op d'mikrobiell Zesummesetzung zu Dysbiose oder aner Krankheeten féiere kënnen. Dës Studie leet d'Grondlag fir zukünfteg Studien doriwwer, wéi d'Auswierkunge vun PPA op d'Darmzesummesetzung d'mënschlech Gesondheet beaflosse kënnen.
D'Datensätz, déi an dëser Studie presentéiert ginn, sinn an Online-Repositories verfügbar. Den Numm vum Repository an d'Accessiounsnummer sinn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Dës Déierstudie gouf vum University of Central Florida Institutional Animal Care and Use Committee (UCF-IACUC) guttgeheescht (Animal Use Permit Number: PROTO202000002). Dës Studie entsprécht de lokale Gesetzer, Reglementer an institutionellen Ufuerderungen.
NG: Konzeptualiséierung, Datenkuratioun, Formal Analyse, Enquête, Methodologie, Software, Visualiséierung, Schreiwen (Originalentworf), Schreiwen (Iwwerpréiwung & Redaktioun). LA: Konzeptualiséierung, Datenkuratioun, Methodologie, Ressourcen, Schreiwen (Iwwerpréiwung & Redaktioun). SH: Formal Analyse, Software, Schreiwen (Iwwerpréiwung & Redaktioun). SA: Enquête, Schreiwen (Iwwerpréiwung & Redaktioun). Chief Judge: Enquête, Schreiwen (Iwwerpréiwung & Redaktioun). SN: Konzeptualiséierung, Projetverwaltung, Ressourcen, Supervisioun, Schreiwen (Iwwerpréiwung & Redaktioun). TA: Konzeptualiséierung, Projetverwaltung, Supervisioun, Schreiwen (Iwwerpréiwung & Redaktioun).
D'Auteuren hunn erkläert, datt si keng finanziell Ënnerstëtzung fir d'Fuerschung, d'Autorschaft an/oder d'Publikatioun vun dësem Artikel kritt hunn.
D'Auteuren erklären, datt d'Fuerschung ouni kommerziell oder finanziell Bezéiungen duerchgefouert gouf, déi als potenziell Interessenkonflikter kéinte interpretéiert ginn. Net zoutreffend.
All Meenungen, déi an dësem Artikel ausgedréckt ginn, sinn eleng déi vun den Autoren a reflektéieren net onbedéngt d'Meenunge vun hiren Institutiounen, Verleeger, Redaktoren oder Rezensenten. All Produkter, déi an dësem Artikel evaluéiert ginn, oder all Fuerderungen, déi vun hire Produzenten gemaach ginn, ginn net vum Verleeger garantéiert oder ënnerstëtzt.
Ergänzungsmaterial fir dësen Artikel kann online fonnt ginn: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Propionsäure induzéiert Gliose an Neuroinflammatioun andeems se de PTEN/AKT-Wee bei Autismus-Spektrum-Stéierungen reguléiert. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Statistesch Analyse vun Zesummesetzungsdaten. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Firmicutes/Bacteroidetes-Verhältnis als Risikofaktor fir Broschtkriibs. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Differenzialexpressionsanalyse vu Sequenzzueldaten. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Fäkal Mikrobiota an de Metabolom bei Kanner mat Autismus a pervasiver Entwécklungsstéierung, net anescht spezifizéiert. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Bakteriell neurometabolesch Charakteristike vun der Darmflora bei jonke Kanner mat Autismus-Spektrum-Stéierungen. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). De Mikrobiom als mënschlecht Organ. Clinical Microbiology and Infection 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Nei Erkenntnesser an d'Physiologie vu Propionsäure produzéierende Bakterien: Anaerotignum propionicum an Anaerotignum neopropionicum (fréier Clostridium propionicum a Clostridium neopropionicum). Mikroorganismen 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Maternal Ernährung an Fetal Entwécklung. J Nutt. 134, 2169-2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., a Hochberg, J. (1995). Kontroll vun der falsch-positiver Rate: E prakteschen an effizienten Usaz fir multiple Tester. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x