Immunmoduléierend Metabolitte sinn e Schlësselmerkmal vum Tumor-Mikroumfeld (TME), awer mat e puer Ausnamen bleift hir Identitéit gréisstendeels onbekannt. Hei hu mir Tumoren an T-Zellen aus den Tumoren an Aszites vu Patienten mat héichgradegem serösem Karzinom (HGSC) analyséiert, fir de Metabolom vun dësen ënnerschiddlechen TME-Kompartimenter ze weisen. Aszites- an Tumorzellen hunn extensiv Metabolit-Ënnerscheeder. Am Verglach mat Aszites sinn déi tumorinfiltréierend T-Zellen signifikant un 1-Methylnicotinamid (MNA) beräichert. Obwuel den Niveau vun MNA an T-Zellen erhéicht ass, ass d'Expressioun vun Nikotinamid-N-Methyltransferase (en Enzym, dat den Transfer vu Methylgruppen vun S-Adenosylmethionin op Nikotinamid katalyséiert) op Fibroblasten an Tumorzellen limitéiert. Funktionell induzéiert MNA T-Zellen, den tumorfördernden Zytokin Tumornekrosefaktor Alpha ze sekretéieren. Dofir dréit TME-ofgeleet MNA zur Immunreguléierung vun T-Zellen bäi a stellt e potenziellt Immuntherapie-Zil fir d'Behandlung vu mënschleche Kriibs duer.
Tumor-ofgeleet Metabolitte kënnen en déifgräifenden hemmenden Effekt op d'Antitumor-Immunitéit hunn, an ëmmer méi Beweiser weisen datt se och als Schlësseldreiwkraaft fir d'Krankheetsprogressioun dénge kënnen (1). Nieft dem Warburg-Effekt huet rezent Aarbecht ugefaangen den metaboleschen Zoustand vun Tumorzellen a seng Relatioun mam Immunzoustand vun der Tumor-Mikroumfeld (TME) ze charakteriséieren. Studien iwwer Mausmodeller a mënschlechen T-Zellen hunn gewisen, datt de Glutaminmetabolismus (2), den oxidativen Metabolismus (3) an de Glukosmetabolismus (4) onofhängeg op verschidden Immunzell-Ënnergruppen wierke kënnen. Verschidde Metabolitte an dëse Weeër hemmen d'Antitumorfunktioun vun T-Zellen. Et gouf bewisen, datt d'Blockad vum Coenzym Tetrahydrobiopterin (BH4) d'Proliferatioun vun T-Zellen beschiedege kann, an d'Erhéijung vu BH4 am Kierper kann d'Antitumor-Immunantwort, déi duerch CD4 an CD8 vermittelt gëtt, verbesseren. Zousätzlech kann den immunsuppressiven Effekt vu Kynurenin duerch d'Administratioun vu BH4 (5) gerett ginn. Beim Isocitratdehydrogenase (IDH) mutanten Glioblastom hemmt d'Sekretioun vum enantiometabolesche (R)-2-Hydroxyglutarat (R-2-HG) d'Aktivatioun, d'Proliferatioun an d'Zytolyseaktivitéit vun T-Zellen (6). Viru kuerzem gouf gewisen, datt Methylglyoxal, e Nebenprodukt vun der Glykolyse, vu Suppressorzellen vu myeloidem Urspronk produzéiert gëtt, an den Transfer vu Methylglyoxal an T-Zellen kann d'Funktioun vun den Effektor-T-Zellen hemmen. An der Behandlung kann d'Neutraliséierung vu Methylglyoxal d'Aktivitéit vu myeloid-ofgeleeten Suppressorzellen (MDSC) iwwerwannen an d'Checkpoint-Blockadetherapie a Mausmodeller synergistesch verbesseren (7). Dës Studien ënnersträichen zesummen déi Schlësselroll vun den TME-ofgeleeten Metabolitten bei der Reguléierung vun der Funktioun an der Aktivitéit vun den T-Zellen.
T-Zell-Dysfunktioun gouf wäit verbreet bei Eierstockkriibs gemellt (8). Dëst ass deelweis wéinst de metabolesche Charakteristiken, déi inherent sinn an Hypoxie an anormaler Tumorvaskulatur (9), wat zu der Ëmwandlung vu Glukos an Tryptophan a Nieweprodukter wéi Mëllechsäure a Kynurenin féiert. Exzessive extrazellulärt Laktat reduzéiert d'Produktioun vun Interferon-γ (IFN-γ) a féiert zur Differenzéierung vu myelosuppressiven Ënnergruppen (10, 11). De Konsum vun Tryptophan hemmt direkt d'T-Zellproliferatioun an hemmt d'T-Zell-Rezeptor-Signalgebung (12-14). Trotz dësen Observatiounen gouf vill Aarbecht ronderëm den Immunmetabolismus an der In-vitro-T-Zellkultur mat optiméierte Medien duerchgefouert, oder limitéiert op homolog Mausmodeller in vivo, awer keng vun deenen zwee reflektéiert d'Heterogenitéit vu mënschleche Kriibs an d'physiologesch Makro- a Mikroëmfeld vollstänneg.
E gemeinsamt Merkmal vu Eierstockkriibs ass d'Ausbreedung vum Bauchfell an d'Erscheinung vun Aszites. D'Akkumulatioun vu Zellflëssegkeet an Aszites gëtt mat enger fortgeschrattener Krankheet an enger schlechter Prognose a Verbindung bruecht (15). Laut Berichter ass dëst eenzegaartegt Kompartiment hypoxesch, huet héich Niveauen u vaskulärem endothelialem Wuesstumsfaktor (VEGF) an Indoleamin-2,3-Dioxygenase (IDO) a gëtt vun T-Reguléierungszellen a myeloid-inhibitoresche Zellen infiltréiert (15-18). D'metabolescht Ëmfeld vun Aszites kann anescht sinn wéi dat vum Tumor selwer, sou datt d'Reprogramméierung vun T-Zellen am peritoneale Raum net kloer ass. Zousätzlech kënnen déi wichtegst Ënnerscheeder an Heterogenitéit tëscht Aszites a Metabolitten, déi an der Tumorëmfeld präsent sinn, d'Infiltratioun vun Immunzellen an hir Funktioun op Tumoren behënneren, a weider Fuerschung ass néideg.
Fir dës Problemer ze léisen, hu mir eng sensibel Zelltrennungs- a Flëssegkeetschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Method entwéckelt, fir verschidden Zelltypen (inklusiv CD4+- an CD8+-T-Zellen) souwéi bannent an tëscht Tumoren ze studéieren. Seng Metabolitte betreffen Zellen an der selwechter Aszites- an Tumorëmfeld vum Patient. Mir benotzen dës Method a Verbindung mat héichdimensionaler Flowzytometrie an Eenzelzell-RNA-Sequenzéierung (scRNA-seq), fir e ganz opléisende Portrait vum metabolesche Status vun dëse Schlësselpopulatiounen ze liwweren. Dës Method huet eng bedeitend Erhéijung vum Niveau vun 1-Methylnicotinamid (MNA) an Tumor-T-Zellen opgedeckt, an In-vitro-Experimenter hunn gewisen, datt den immunmoduléierenden Effekt vun MNA op d'T-Zellfunktioun virdru onbekannt war. Am Allgemengen weist dës Method déi géigesäiteg metabolesch Interaktiounen tëscht Tumoren an Immunzellen op a bitt eenzegaarteg Abléck an d'Immunreguléierungsmetabolitte, déi fir d'Behandlung vun T-Zell-baséierter Eierstockkriibs-Immuntherapie nëtzlech kënne sinn. Behandlungsméiglechkeeten.
Mir hunn héichdimensional Flowcytometrie benotzt fir gläichzäiteg d'Glukosopnam [2-(N-(7-Nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) an d'mitochondrial Aktivitéit [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) ze quantifizéieren, déi typesch Marker niewentenee sinn, déi Immunzellen an Tumorzellpopulatiounen ënnerscheeden (Tabell S2 a Figur S1A). Dës Analyse huet gewisen, datt Aszites an Tumorzellen am Verglach mat T-Zellen méi héich Glukosopnamniveauen hunn, awer méi kleng Ënnerscheeder an der mitochondrialer Aktivitéit hunn. Déi duerchschnëttlech Glukosopnam vun Tumorzellen [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ass dräi bis véier Mol sou héich wéi déi vun T-Zellen, an déi duerchschnëttlech Glukosopnam vun CD4+ T-Zellen ass 1,2 Mol sou héich wéi déi vun CD8+ T-Zellen, wat drop hiweist, datt Tumorinfiltréierend Lymphozyten (TIL) och am selwechten TME aner metabolesch Ufuerderungen hunn (Figur 1A). Am Géigesaz dozou ass d'mitochondrial Aktivitéit an Tumorzellen ähnlech wéi déi vun CD4+ T-Zellen, an d'mitochondrial Aktivitéit vun deenen zwou Zelltypen ass méi héich wéi déi vun CD8+ T-Zellen (Figur 1B). Am Allgemengen weisen dës Resultater den metaboleschen Niveau. D'metabolesch Aktivitéit vun Tumorzellen ass méi héich wéi déi vun CD4+ T-Zellen, an d'metabolesch Aktivitéit vun CD4+ T-Zellen ass méi héich wéi déi vun CD8+ T-Zellen. Trotz dësen Effekter iwwer d'Zelltypen gëtt et keen konsequenten Ënnerscheed am metabolesche Status vun CD4+ an CD8+ T-Zellen oder hire relative Proportiounen an Aszites am Verglach mat Tumoren (Figur 1C). Am Géigesaz dozou ass an der CD45-Zellfraktioun den Undeel vun EpCAM+ Zellen am Tumor am Verglach mat Aszites eropgaang (Figur 1D). Mir hunn och en däitlechen metaboleschen Ënnerscheed tëscht EpCAM+ an EpCAM- Zellkomponenten observéiert. EpCAM+ (Tumor) Zellen hunn eng méi héich Glukosopnahm a mitochondrial Aktivitéit wéi EpCAM- Zellen, wat vill méi héich ass wéi d'metabolesch Aktivitéit vu Fibroblasten an Tumorzellen an TME (Figur 1, E an F).
(A an B) Median Fluoreszenzintensitéit (MFI) vun der Glukosopnahm (2-NBDG) (A) a mitochondrialen Aktivitéit vun CD4+ T-Zellen (MitoTracker donkelrout) (B) Representativ Grafiken (lénks) an tabuléiert Donnéeën (riets), CD8+ T-Zellen an EpCAM+ CD45-Tumorzellen aus Aszites an Tumor. (C) De Verhältnis vun CD4+ an CD8+ Zellen (vun CD3+ T-Zellen) an Aszites an Tumor. (D) Proportioun vun EpCAM+ Tumorzellen an Aszites an Tumor (CD45−). (E an F) EpCAM + CD45-Tumor an EpCAM-CD45-Matrix Glukosopnahm (2-NBDG) (E) a mitochondrialen Aktivitéit (MitoTracker donkelrout) (F) representativ Grafiken (lénks) an tabuléiert Donnéeën (riets) Aszites an Tumorzellen. (G) Representativ Grafiken vun der CD25-, CD137- an PD1-Expressioun duerch Flowcytometrie. (H an I) CD25-, CD137- an PD1-Expressioun op CD4+ T-Zellen (H) an CD8+ T-Zellen (I). (J an K) Naiv, zentral Gedächtnis- (Tcm), Effektor- (Teff) an Effektor-Gedächtnis- (Tem)-Phenotypen baséiert op der Expressioun vu CCR7 an CD45RO. Representativ Biller (lénks) an tabellaresch Daten (riets) vun CD4+ T-Zellen (J) an CD8+ T-Zellen (K) an Aszites an Tumoren. P-Wäerter bestëmmt duerch gepaarten t-Test (*P<0,05, **P<0,01 an ***P<0,001). D'Linn representéiert iwwereneestëmmend Patienten (n = 6). FMO, Fluoreszenz minus eent; MFI, Median Fluoreszenzintensitéit.
Weider Analysen hunn aner bedeitend Ënnerscheeder tëscht dem héich opgeléisten T-Zell-Phänotypstatus opgedeckt. Den aktivéierten (Figur 1, G bis I) an den Effektor-Gediechtnis (Figur 1, J an K) an Tumoren si vill méi heefeg wéi Aszites (Proportioun vun CD3+ T-Zellen). Ähnlech huet d'Analyse vum Phenotyp duerch d'Expressioun vun Aktivéierungsmarker (CD25 an CD137) an Depletiounsmarker [programméiert Zelltodprotein 1 (PD1)] gewisen, datt obwuel d'metabolesch Charakteristike vun dëse Populatiounen ënnerschiddlech sinn (Figur S1, B bis E), awer keng bedeitend metabolesch Ënnerscheeder konsequent tëscht naivem, Effektor- oder Gedächtnis-Ënnergruppen observéiert goufen (Figur S1, F bis I). Dës Resultater goufen duerch d'Benotzung vu maschinellem Léiermethoden bestätegt fir automatesch Zellphenotypen zouzeweisen (21), wat weider d'Präsenz vun enger grousser Zuel vu Knueweesmarkzellen (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) am Aszites vum Patient opgedeckt huet (Figur S2A). Ënnert all den identifizéierten Zelltypen huet dës myeloesch Zellpopulatioun déi héchst Glukosopnahm an mitochondrial Aktivitéit gewisen (Figur S2, B bis G). Dës Resultater ënnersträichen déi staark metabolesch Ënnerscheeder tëscht de verschiddene Zelltypen, déi an Aszites an Tumoren bei HGSC-Patienten fonnt ginn.
Déi Haapterausfuerderung beim Versteesdemech vun de metabolonomesche Charakteristike vun TIL ass d'Noutwennegkeet, T-Zellprouwen mat ausreechender Rengheet, Qualitéit a Quantitéit aus Tumoren ze isoléieren. Rezent Studien hunn gewisen, datt Sortéierungs- a Perlenanreicherungsmethoden, déi op Flowcytometrie baséieren, zu Ännerungen an de Zellmetabolitprofiler féiere kënnen (22-24). Fir dëst Problem ze léisen, hu mir d'Perlenanreicherungsmethod optimiséiert, fir TIL aus chirurgesch resektionéiertem mënschlechen Eierstockkriibs ze isoléieren an ze isoléieren, ier se duerch LC-MS/MS analyséiert gëtt (kuckt Materialien a Methoden; Figur 2A). Fir den allgemengen Impakt vun dësem Protokoll op d'Metabolitännerungen ze bewäerten, hu mir d'Metabolitprofiler vun T-Zellen, déi vu gesonde Spender no dem uewe genannten Perlentrennungsschritt aktivéiert goufen, mat Zellen verglach, déi net perletrennt goufen, mä op Äis bliwwe sinn. Dës Qualitéitskontrollanalyse huet festgestallt, datt et eng héich Korrelatioun tëscht dësen zwou Konditiounen gëtt (r = 0,77), an d'technesch Widderhuelbarkeet vun der Grupp vun 86 Metabolitten huet eng héich Widderhuelbarkeet (Figur 2B). Dofir kënnen dës Methoden eng korrekt Metabolitanalyse an Zellen duerchféieren, déi eng Zelltypanreicherung duerchféieren, wouduerch déi éischt Plattform mat héijer Opléisung fir d'Identifikatioun vu spezifesche Metabolitten an HGSC ugebuede gëtt, wouduerch d'Leit e méi déift Verständnis vun der Zellspezifizitéit vum sexuellen Metabolismusprogramm kréien.
(A) Schematescht Diagramm vun der magnéitescher Perlenanreicherung. Virun der Analyse duerch LC-MS/MS ginn d'Zellen dräi hannereneen Ronnen vun der magnéitescher Perlenanreicherung duerchgefouert oder bleiwen op Äis. (B) Den Effekt vum Anreicherungstyp op d'Heefegkeet vu Metabolitten. Den Duerchschnëtt vun dräi Miessunge fir all Anreicherungstyp ± SE. Déi gro Linn representéiert eng 1:1 Bezéiung. D'Intra-Klass Korrelatioun (ICC) vu widderhollte Miessunge gëtt an der Achsbezeechnung gewisen. NAD, Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid. (C) Schematescht Diagramm vum Workflow vun der Patientenmetabolitanalyse. Aszites oder Tumoren ginn vu Patienten gesammelt a kryokonservéiert. E klenge Portioun vun all Prouf gouf duerch Flusszytometrie analyséiert, während déi reschtlech Prouwe dräi Ronnen vun der Anreicherung fir CD4+, CD8+ an CD45- Zellen duerchgefouert goufen. Dës Zellfraktioune goufen mat LC-MS/MS analyséiert. (D) Hëtzekaart vun der standardiséierter Metabolit-Heefegkeet. Den Dendrogramm representéiert d'Ward-Clustering vun euklideschen Distanzen tëscht de Prouwe. (E) Haaptkomponentenanalyse (PCA) vun der Metabolitkaart vun der Prouf, déi dräi Replikater vun all Prouf weist, d'Prouwe vum selwechte Patient sinn duerch eng Linn verbonnen. (F) D'PCA vum Metabolitprofil vun der Prouf, déi um Patient konditionéiert ass (d.h. mat partieller Redundanz); den Prouftyp ass duerch déi konvex Hüll limitéiert. PC1, Haaptkomponent 1; PC2, Haaptkomponent 2.
Duerno hu mir dës Anreicherungsmethod ugewannt fir 99 Metabolitten an den CD4+-, CD8+- an CD45-Zellfraktiounen an den primären Aszites an Tumoren vu sechs HGSC-Patienten z'analyséieren (Figur 2C, Figur S3A an Tabelle S3 an S4). D'Populatioun vun Interessi mécht 2% bis 70% vun der ursprénglecher grousser Prouf vu liewegen Zellen aus, an den Undeel vun den Zellen variéiert staark tëscht de Patienten. Nodeems d'Perlen getrennt goufen, mécht déi anreichert Fraktioun vun Interessi (CD4+, CD8+ oder CD45-) am Duerchschnëtt méi wéi 85% vun alle liewegen Zellen an der Prouf aus. Dës Anreicherungsmethod erlaabt eis, Zellpopulatiounen aus dem Metabolismus vum mënschlechen Tumorgewebe z'analyséieren, wat onméiglech ass mat grousse Proben ze maachen. Mat dësem Protokoll hu mir festgestallt, datt l-Kynurenin an Adenosin, dës zwee gutt charakteriséiert immunsuppressiv Metabolitten, an Tumor-T-Zellen oder Tumorzellen erhéicht waren (Figur S3, B an C). Dofir demonstréieren dës Resultater d'Gläichheet an d'Fäegkeet vun eiser Zelltrennungs- a Massenspektrometrietechnologie fir biologesch wichteg Metabolitten am Patientgewebe ze fannen.
Eis Analyse huet och eng staark metabolesch Trennung vun Zelltypen bannent a tëscht Patienten opgedeckt (Figur 2D a Figur S4A). Besonnesch am Verglach mat anere Patienten huet de Patient 70 aner metabolesch Charakteristiken gewisen (Figur 2E a Figur S4B), wat drop hiweist, datt et eng substantiell metabolesch Heterogenitéit tëscht de Patienten kéint ginn. Et ass derwäert ze bemierken, datt am Verglach mat anere Patienten (1,2 bis 2 Liter; Tabelle S1) déi total Quantitéit un Aszites, déi beim Patient 70 gesammelt gouf (80 ml), méi kleng war. D'Kontroll vun der Heterogenitéit tëscht de Patienten während der Haaptkomponentenanalyse (zum Beispill mat Hëllef vun der partieller Redundanzanalyse) weist konsequent Ännerungen tëscht Zelltypen, an d'Zelltypen an/oder d'Mikroëmfeld sinn no dem Metabolitprofil kloer aggregéiert (Figur 2F). D'Analyse vun eenzelne Metabolitten huet dës Effekter ervirgehuewen a bedeitend Ënnerscheeder tëscht Zelltypen a Mikroëmfeld opgedeckt. Et ass derwäert ze bemierken, datt den extremsten observéierten Ënnerscheed MNA ass, deen normalerweis a CD45- Zellen an a CD4+ an CD8+ Zellen, déi den Tumor infiltréieren, beräichert ass (Figur 3A). Fir CD4+ Zellen ass dësen Effekt am offensichtlechsten, an den MNA an den CD8+ Zellen schéngt och staark vun der Ëmwelt beaflosst ze sinn. Dëst ass awer net wichteg, well nëmmen dräi vun de sechs Patienten op Tumor CD8+ Scores evaluéiert kënne ginn. Nieft dem MNA sinn an ënnerschiddlechen Zelltypen an Aszites an Tumoren och aner Metabolitten, déi schlecht an TIL charakteriséiert sinn, differenziell räich (Figuren S3 an S4). Dofir weisen dës Donnéeën e villverspriechend Set vun immunmoduléierende Metabolitten fir weider Fuerschung.
(A) Normaliséierten Inhalt vun MNA an CD4+, CD8+ an CD45- Zellen aus Aszites an Tumor. De Boxplot weist de Median (Linn), den Interquartilberäich (Frame Scharnier) an den Datenberäich, bis zu dem 1,5-fache vum Interquartilberäich (Frame Whisker). Wéi a Patient Materials and Methods beschriwwen, benotzt de Limma-Wäert vum Patient fir de P-Wäert ze bestëmmen (*P<0,05 an **P<0,01). (B) Schematescht Diagramm vum MNA-Metabolismus (60). Metabolitten: S-Adenosyl-1-Methionin; SAH, S-Adenosin-1-Homocystein; NA, Nikotinamid; MNA, 1-Methylnikotinamid; 2-PY, 1-Methyl-2-pyridon-5-carboxamid; 4-PY, 1-Methyl-4-pyridon-5-carboxamid; NR, Nikotinamid-Ribose; NMN, Nikotinamid-Mononukleotid. Enzymer (gréng): NNMT, Nikotinamid-N-Methyltransferase; SIRT, Sirtuinen; NAMPT, Nikotinamid-Phosphoribosyltransferase; AOX1, Aldehyd-Oxidase 1; NRK, Nikotinamid-Ribosid-Kinase; NMNAT, Nikotinamid-Mononukleotid-Adenylat-Transferase; Pnp1, Purinnukleosid-Phosphorylase. (C) t-SNE vun der scRNA-Seq vun Aszites (gro) an Tumor (rout; n = 3 Patienten). (D) NNMT-Expressioun a verschiddene Zellpopulatiounen, identifizéiert mat scRNA-Seq. (E) Expressioun vun NNMT an AOX1 an SK-OV-3, mënschlechen embryonalen Nieren (HEK) 293T, T-Zellen an MNA-behandelten T-Zellen. Déi gefalte Expressioun gëtt am Verhältnes zu SK-OV-3 gewisen. Den Expressiounsmuster mat SEM gëtt gewisen (n = 6 gesond Spender). Ct-Wäerter méi grouss wéi 35 ginn als net nogewise (UD) ugesinn. (F) Expressioun vun SLC22A1 an SLC22A2 an SK-OV-3, HEK293T, T-Zellen an T-Zellen, déi mat 8mM MNA behandelt goufen. Déi gefalten Expressioun gëtt am Verglach zu SK-OV-3 gewisen. Den Expressiounsmuster mat SEM gëtt gewisen (n = 6 gesond Donateuren). Ct-Wäerter méi grouss wéi 35 gëllen als net nogewise (UD). (G) Zell-MNA-Gehalt an aktivéierte gesonden Donateur-T-Zellen no 72 Stonnen Inkubatioun mat MNA. Den Expressiounsmuster mat SEM gëtt gewisen (n = 4 gesond Donateuren).
MNA gëtt produzéiert andeems d'Methylgrupp vun S-Adenosyl-1-Methionin (SAM) op Nikotinamid (NA) iwwer Nikotinamid-N-Methyltransferase (NNMT; Figur 3B) transferéiert gëtt. NNMT gëtt an enger Villfalt vu mënschleche Kriibsarten iwwerdriwwen expriméiert a gëtt mat Proliferatioun, Invasioun a Metastasen a Verbindung bruecht (25-27). Fir d'Quell vun MNA an T-Zellen an TME besser ze verstoen, hu mir scRNA-seq benotzt fir d'Expressioun vun NNMT iwwer Zelltypen an den Aszites an Tumoren vun dräi HGSC-Patienten ze charakteriséieren (Tabell S5). D'Analyse vun ongeféier 6.500 Zellen huet gewisen, datt an Aszites- an Tumorëmfeld d'NNMT-Expressioun op déi vermutlech Fibroblast- a Tumorzellpopulatiounen limitéiert war (Figur 3, C an D). Et ass derwäert ze bemierken, datt et keng offensichtlech NNMT-Expressioun an iergendenger Populatioun gëtt, déi PTPRC (CD45+) expriméiert (Figur 3D a Figur S5A), wat drop hiweist, datt den MNA, deen am Metabolitspektrum detektéiert gouf, an T-Zellen agefouert gouf. D'Expressioun vun der Aldehydoxidase 1 (AOX1) konvertéiert MNA an 1-Methyl-2-pyridon-5-carboxamid (2-PYR) oder 1-Methyl-4-pyridon-5-carboxamid (4-PYR); Figur 3B) ass och op d'Populatioun vu Fibroblasten beschränkt, déi COL1A1 expriméieren (Figur S5A), wat zesummen drop hiweist, datt T-Zellen d'Fäegkeet fir e konventionellen MNA-Metabolismus feelen. D'Expressiounsmuster vun dësen MNA-verwandte Genen gouf mat engem zweeten onofhängege Zelldatensatz aus Aszites vu HGSC-Patienten verifizéiert (Figur S5B; n = 6) (16). Zousätzlech huet d'quantitativ Polymerasekettenreaktiounsanalyse (qPCR) vu gesonden Donor-T-Zellen, déi mat MNA behandelt goufen, gewisen, datt am Verglach mat Kontroll-SK-OV-3-Ovariumtumorzellen NNMT oder AOX1 bal net expriméiert gouf (Figur 3E). Dës onerwaart Resultater weisen drop hin, datt MNA vu Fibroblasten oder Tumoren an Nopesch-T-Zellen an TME ausgeschott ka ginn.
Obwuel Kandidaten d'Famill vun den organesche Kationentransporter 1 bis 3 (OCT1, OCT2 an OCT3) enthalen, déi vun der Famill vun de lösleche Carrier 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 an SLC22A3) kodéiert ginn, sinn déi potenziell Transporter vun MNA nach ëmmer ondefinéiert (28). QPCR vun mRNA aus gesonden Donor-T-Zellen huet niddreg Expressiounsniveauen vun SLC22A1 gewisen, awer net nogewise Niveauen vun SLC22A2, wat bestätegt huet, datt et virdru schonn an der Literatur beschriwwe gouf (Figur 3F) (29). Am Géigesaz dozou huet d'SK-OV-3 Eierstocktumorzell-Linn héich Niveauen vun deenen zwou Transporter expriméiert (Figur 3F).
Fir d'Méiglechkeet ze testen, datt T-Zellen d'Fäegkeet hunn, friemt MNA opzehuelen, goufen gesond Donor-T-Zellen 72 Stonnen a Präsenz vu verschiddene Konzentratioune vun MNA kultivéiert. Wann exogent MNA net do ass, kann den zellulären Inhalt vun MNA net nogewise ginn (Figur 3G). Aktivéiert T-Zellen, déi mat exogenem MNA behandelt goufen, hunn awer eng dosisofhängeg Erhéijung vum MNA-Gehalt an den Zellen gewisen, bis zu 6 mM MNA (Figur 3G). Dëst Resultat weist drop hin, datt TIL trotz dem niddrege Niveau vun der Transporterexpression an dem Manktem vum Haaptenzym, dat fir den intrazelluläre MNA-Metabolismus verantwortlech ass, ëmmer nach MNA ophuele kann.
De Spektrum vu Metabolitten an den T-Zellen vun de Patienten an In-vitro-MNA-Absorptiounsexperimenter erhéijen d'Méiglechkeet, datt Kriibs-assoziéiert Fibroblasten (CAF) MNA sekretéieren an Tumorzellen de Phenotyp a Funktioun vun TIL reguléiere kënnen. Fir den Effekt vun MNA op T-Zellen ze bestëmmen, goufen gesond Donor-T-Zellen in vitro an der Präsenz oder Absenz vun MNA aktivéiert, an hir Proliferatioun a Zytokinproduktioun goufen evaluéiert. No 7 Deeg MNA an der héchster Dosis ze addéieren, war d'Populatiounsverduebelungszuel mëttelméisseg reduzéiert, während d'Vigor bei allen Dosen erhale bliwwen ass (Figur 4A). Zousätzlech huet d'Behandlung vun exogener MNA zu enger Erhéijung vum Undeel vun CD4+ an CD8+ T-Zellen gefouert, déi Tumornekrosefaktor-α (TNFα; Figur 4B) expriméieren. Am Géigesaz dozou war déi intrazellulär Produktioun vun IFN-γ an CD4+ T-Zellen signifikant reduzéiert, awer net an CD8+ T-Zellen, an et gouf keng signifikant Ännerung vum Interleukin 2 (IL-2; Figur 4, C an D). Dofir huet den enzymgekoppelten Immunosorbent-Assay (ELISA) vun Iwwerstand aus dësen MNA-behandelten T-Zellkulturen eng bedeitend Erhéijung vun TNFα, eng Ofsenkung vun IFN-γ a keng Ännerung vun IL-2 gewisen (Figur 4, E bis G). D'Ofsenkung vun IFN-γ weist drop hin, datt MNA eng Roll bei der Hemmung vun der Antitumoraktivitéit vun T-Zellen spille kéint. Fir den Effekt vun MNA op T-Zell-vermittelte Zytotoxizitéit ze simuléieren, gi chimäresch Antigenrezeptor-T (FRα-CAR-T)-Zellen, déi op Folatrezeptor α a CAR-T (GFP), déi duerch gréng fluoreszent Protein (GFP)-CAR-T)-Zellen reguléiert sinn, vu gesonde periphere Bluttmononuklearzellen (PBMC) aus dem Spenderblut produzéiert. CAR-T-Zellen goufen 24 Stonnen a Präsenz vun MNA kultivéiert an duerno mat mënschlechen SK-OV-3-Ovariumtumorzellen zesumme kultivéiert, déi Folatrezeptor α an engem Effektor-Zil-Verhältnis vun 10:1 expriméieren. D'MNA-Behandlung huet zu enger bedeitender Ofsenkung vun der Tötungsaktivitéit vun FRα-CAR-T-Zellen gefouert, déi ähnlech wéi FRα-CAR-T-Zellen war, déi mat Adenosin behandelt goufen (Figur 4H).
(A) Gesamtzuel vun de liewensfäege Zellen a Populatiounsverduebelung (PD) direkt aus der Kultur um 7. Dag. De Balkendiagramm representéiert de Mittelwert + SEM vu sechs gesonde Spender. Representéiert Daten aus op d'mannst n = 3 onofhängege Experimenter. (B bis D) CD3/CD28 an IL-2 goufen benotzt fir T-Zellen bei hire jeeweilege MNA-Konzentratioune fir 7 Deeg z'aktivéieren. Virun der Analyse goufen d'Zellen 4 Stonnen laang mat PMA/Ionomycin a GolgiStop stimuléiert. TNFα (B) Expressioun an T-Zellen. Beispillbild (lénks) an Tabellendaten (riets) vun der TNFα Expressioun a liewegen Zellen. IFN-γ (C) an IL-2 (D) Expressioun an T-Zellen. D'Expressioun vu Zytokine gouf duerch Flusszytometrie gemooss. De Balkendiagramm representéiert de Mittelwert (n = 6 gesond Spender) + SEM. Benotzt eng Een-Wee-Varianzanalyse a widderholl Miessungen (*P<0,05 an **P<0,01) fir de P-Wäert ze bestëmmen. Representéiert Daten aus op d'mannst n = 3 onofhängege Experimenter. (E bis G) CD3/CD28 an IL-2 goufen benotzt fir T-Zellen 7 Deeg laang bei hire jeeweilege MNA-Konzentratioune z'aktivéieren. De Medium gouf virun an no 4 Stonne PMA/Ionomycin-Stimulatioun gesammelt. D'Konzentratioune vun TNFα (E), IFN-γ (F) an IL-2 (G) goufen duerch ELISA gemooss. De Balkendiagramm representéiert de Mëttelwäert (n = 5 gesond Donoren) + SEM. De p-Wäert gouf mat Hëllef vun enger Een-Wee-Varianzanalyse a widderhollte Miessunge bestëmmt (*P<0,05). Déi gepunktete Linn weist d'Detektiounsgrenz vun der Detektioun un. (H) Zell-Lyse-Assay. FRα-CAR-T- oder GFP-CAR-T-Zellen goufen 24 Stonnen laang mat Adenosin (250 μM) oder MNA (10 mM) ugepasst oder net behandelt (Ctrl). De Prozentsaz vun der Doudung vun SK-OV-3-Zellen gouf gemooss. De p-Wäert gouf mam Welch-t-Test bestëmmt (*P<0,5 an **P<0,01).
Fir e mechanistescht Verständnis vun der MNA-ofhängeger TNFα-Expressiounsreguléierung ze kréien, goufen d'Ännerungen an der TNFα mRNA vun MNA-behandelten T-Zellen evaluéiert (Figur 5A). Gesond Donor-T-Zellen, déi mat MNA behandelt goufen, hunn eng duebel Erhéijung vun den TNFα-Transkriptiounsniveauen gewisen, wat drop hiweist, datt MNA vun der TNFα-Transkriptiounsreguléierung ofhängeg ass. Fir dëse méigleche Reguléierungsmechanismus z'ënnersichen, goufen zwou bekannt Transkriptiounsfaktoren, déi TNFα reguléieren, nämlech den aktivéierten T-Zell-Nuklearfaktor (NFAT) a spezifescht Protein 1 (Sp1), als Äntwert op d'MNA-Bindung un den proximalen TNFα-Promoter evaluéiert (30). Den TNFα-Promoter enthält 6 identifizéiert NFAT-Bindungsplazen an 2 Sp1-Bindungsplazen, déi sech op enger Plaz iwwerlappen [-55 Basenpaaren (bp) vum 5'cap] (30). Chromatin-Immunoprezipitatioun (ChIP) huet gewisen, datt d'Bindung vu Sp1 un den TNFα-Promoter bei der Behandlung mat MNA dräifach zougeholl huet. D'Inkorporatioun vun NFAT ass och zougeholl an huet ëmmer méi wichteg ginn (Figur 5B). Dës Donnéeën weisen drop hin, datt MNA d'Expressioun vun TNFα iwwer Sp1-Transkriptioun reguléiert, a manneren Mooss d'Expressioun vun NFAT.
(A) Am Verglach mat T-Zellen, déi ouni MNA kultivéiert goufen, ass d'Verännerung vun der TNFα-Expressioun an T-Zellen, déi mat MNA behandelt goufen, eng Verännerung vun der TNFα-Expressioun an T-Zellen, déi mat MNA behandelt goufen. D'Expressiounsmuster mat SEM gëtt gewisen (n = 5 gesond Donatoren). Representéiert Daten aus op d'mannst n = 3 onofhängege Experimenter. (B) Den TNFα-Promoter vun T-Zellen, déi mat oder ouni 8 mM MNA behandelt goufen, nodeems NFAT a Sp1 mat (Ctrl) a PMA/Ionomycin-Stimulatioun fir 4 Stonnen kombinéiert goufen. Immunoglobulin G (IgG) an H3 goufen als negativ respektiv positiv Kontrollen fir d'Immunoprezipitatioun benotzt. D'Quantifizéierung vum ChIP huet gewisen, datt d'Bindung vu Sp1 an NFAT un den TNFα-Promoter an MNA-behandelten Zellen e puermol am Verglach mat der Kontroll eropgaangen ass. Representéiert Daten aus op d'mannst n = 3 onofhängege Experimenter. De P-Wäert gouf duerch multiple t-Tester bestëmmt (*** P <0,01). (C) Am Verglach mat den Aszites vun HGSC hunn T-Zellen (net-zytotoxesch) eng erhéicht Expressioun vun TNF am Tumor gewisen. D'Faarwe representéieren verschidde Patienten. Déi ugewise Zellen goufen zoufälleg op 300 gesammelt a gerëselt fir d'Iwwerdrawing ze limitéieren (** Padj = 0,0076). (D) Virgeschloe Modell vun MNA fir Eierstockkriibs. MNA gëtt an Tumorzellen a Fibroblasten am TME produzéiert a vun T-Zellen opgeholl. MNA erhéicht d'Bindung vu Sp1 un den TNFα-Promoter, wat zu enger erhéichter TNFα-Transkriptioun an TNFα-Zytokinproduktioun féiert. MNA verursaacht och eng Ofsenkung vun IFN-γ. D'Inhibitioun vun der T-Zellfunktioun féiert zu enger reduzéierter Tötungsfäegkeet an engem beschleunegten Tumorwuesstum.
Berichter no huet TNFα front- an hënneschtofhängeg Antitumor- an Antitumoreffekter, awer et huet eng bekannt Roll bei der Fërderung vum Wuesstum a vun der Metastaséierung vun Eierstockkriibs (31-33). Berichter no ass d'Konzentratioun vun TNFα an Aszites an Tumorgewebe bei Patienten mat Eierstockkriibs méi héich wéi a guttartigen Gewëss (34-36). Wat de Mechanismus ugeet, kann TNFα d'Aktivéierung, d'Funktioun an d'Proliferatioun vu wäisse Bluttzellen reguléieren an de Phenotyp vu Kriibszellen änneren (37, 38). Am Aklang mat dëse Befunde huet d'Differenzialgenexpressionsanalyse gewisen, datt TNF an T-Zellen an Tumorgewebe am Verglach mat Aszites signifikant eropreguléiert war (Figur 5C). D'Erhéijung vun der TNF-Expressioun war nëmmen an T-Zellpopulatiounen mat engem net-zytotoxesche Phenotyp evident (Figur S5A). Zesummegefaasst ënnerstëtzen dës Donnéeën d'Meenung, datt MNA duebel immunsuppressiv an tumorfördernd Effekter bei HGSC huet.
Fluoreszenzmarkéierung baséiert op Flowcytometrie ass déi Haaptmethod fir d'Studie vum TIL-Metabolismus ginn. Dës Studien hunn gewisen, datt am Verglach mat periphere Bluttlymphozyten oder T-Zellen aus sekundäre Lymphorganer, murine an mënschlechen TIL eng méi héich Tendenz hunn, Glukos opzehuelen (4, 39) an e graduelle Verloscht vun der Mitochondriefunktioun (19, 40). Och wann mir ähnlech Resultater an dëser Studie observéiert hunn, ass déi wichtegst Entwécklung de Metabolismus vun Tumorzellen an TIL aus dem selwechte resektéierten Tumorgewebe ze vergläichen. Am Aklang mat e puer vun dëse fréiere Berichter hunn Tumorzellen (CD45-EpCAM+) aus Aszites an Tumoren eng méi héich Glukosopnam wéi CD8+ an CD4+ T-Zellen, wat ënnerstëtzt, datt déi héich Glukosopnam vun Tumorzellen mat T-Zellen verglach ka ginn. De Konzept vun der T-Zellkonkurrenz. TME. Wéi och ëmmer, d'mitochondrial Aktivitéit vun Tumorzellen ass méi héich wéi déi vun CD8+ T-Zellen, awer d'mitochondrial Aktivitéit ass ähnlech wéi déi vun CD4+ T-Zellen. Dës Resultater bestätegen dat neit Thema, datt den oxidativen Metabolismus wichteg fir Tumorzellen ass (41, 42). Si suggeréieren och, datt CD8+ T-Zellen méi ufälleg fir oxidativ Dysfunktioun si wéi CD4+ T-Zellen, oder datt CD4+ T-Zellen aner Kuelestoffquellen ewéi Glukos benotze kënnen, fir d'mitochondrial Aktivitéit z'erhalen (43, 44). Et sollt een drop hiweisen, datt mir keen Ënnerscheed an der Glukosopnahm oder der mitochondrialer Aktivitéit tëscht CD4+ T-Effektoren, T-Effektor-Gedächtnis- an T-zentralen Gedächtniszellen an Aszites observéiert hunn. Ähnlech huet den Differenzéierungszoustand vun CD8+ T-Zellen an Tumoren näischt mat Ännerungen an der Glukosopnahm ze dinn, wat den signifikanten Ënnerscheed tëscht in vitro kultivéierten T-Zellen an in vivo mënschlechen TIL ervirhieft (22). Dës Observatioune goufen och duerch d'Benotzung vun enger onparteiescher automatescher Zellpopulatiounsallokatioun bestätegt, déi weider opgedeckt huet, datt CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ Zellen mat enger méi héijer Glukosopnahm a mitochondrialer Aktivitéit wéi Tumorzellen heefeg sinn, awer eng metabolisch aktiv Zellpopulatioun hunn. Dës Populatioun kéint déi vermutlech Ënnerpopulatioun vu myeloid Suppressorzellen oder plasmazytoid dendritesche Zellen representéieren, déi an der scRNA-seq Analyse identifizéiert goufen. Obwuel béid vun dësen a mënschlechen Eierstocktumoren gemellt goufen [45], brauche se nach ëmmer weider Aarbecht fir dës myeloesch Ënnerpopulatioun ze beschreiwen.
Obwuel Methoden op Basis vu Flusszytometrie déi allgemeng Ënnerscheeder am Glukos- a oxidativen Metabolismus tëscht Zelltypen kläre kënnen, sinn déi genee Metabolitten, déi duerch Glukos oder aner Kuelestoffquellen fir de mitochondriale Metabolismus an TME produzéiert ginn, nach net festgestallt ginn. D'Zouuerdnung vun der Präsenz oder der Absenz vu Metabolitten zu enger bestëmmter TIL-Ënnergrupp erfuerdert d'Reinigung vun der Zellpopulatioun aus dem ausgeschniddene Gewief. Dofir kann eis Zellanreicherungsmethod a Kombinatioun mat Massenspektrometrie Abléck an d'Metabolitten ginn, déi an T-Zellen an Tumorzellpopulatiounen a passenden Patienteprouwen differenziell angereichert sinn. Obwuel dës Method Virdeeler géintiwwer der Fluoreszenz-aktivéierter Zellsortéierung huet, kënne bestëmmte Metabolitbibliothéike wéinst hirer inherenter Stabilitéit an/oder schneller Ëmsazquote beaflosst ginn (22). Trotzdem konnt eis Method zwou unerkannt immunsuppressiv Metabolitten, Adenosin a Kynurenin, identifizéieren, well se staark tëscht de Prouftypen variéieren.
Eis metabonomesch Analyse vun Tumoren an TIL-Subtypen gëtt méi Abléck an d'Roll vu Metabolitten am ovareschen TME. Éischtens hu mir mat Hëllef vu Flowcytometrie festgestallt, datt et keen Ënnerscheed an der mitochondrialer Aktivitéit tëscht Tumoren an CD4+ T-Zellen gouf. Wéi och ëmmer, d'LC-MS/MS-Analyse huet bedeitend Ännerungen an der Heefegkeet vu Metabolitten an dëse Populatiounen opgedeckt, wat drop hiweist, datt Conclusiounen iwwer den TIL-Metabolismus a seng allgemeng metabolesch Aktivitéit eng virsiichteg Interpretatioun erfuerderen. Zweetens ass MNA de Metabolit mam gréissten Ënnerscheed tëscht CD45-Zellen an T-Zellen an Aszites, net an Tumoren. Dofir kënnen d'Kompartimentéierung an d'Tumorlokatioun ënnerschiddlech Auswierkungen op den TIL-Metabolismus hunn, wat déi méiglech Heterogenitéit an enger bestëmmter Mikroumgebung ervirhieft. Drëttens ass d'Expressioun vum MNA-produzéierenden Enzym NNMT haaptsächlech op CAF limitéiert, wat a mannerem Mooss Tumorzellen sinn, awer noweisbar MNA-Niveauen ginn an Tumor-ofgeleeten T-Zellen observéiert. D'Iwwerexpressioun vun NNMT am ovareschen CAF huet e bekannte Kriibsfërderende Effekt, deelweis wéinst der Fërderung vum CAF-Metabolismus, Tumorinvasioun a Metastasen (27). Obwuel den allgemengen TIL-Niveau mëttelméisseg ass, ass d'Expressioun vun NNMT am CAF enk mam mesenchymalen Subtyp vum Cancer Genome Atlas (TCGA) verbonnen, wat mat enger schlechter Prognose assoziéiert ass (27, 46, 47). Schlussendlech ass d'Expressioun vum Enzym AOX1, deen fir den MNA-Degradatioun verantwortlech ass, och op d'CAF-Populatioun limitéiert, wat drop hiweist, datt T-Zellen d'Fäegkeet hunn, MNA ze metaboliséieren. Dës Resultater ënnerstëtzen d'Iddi, datt, obwuel weider Aarbecht néideg ass, fir dëse Befund ze verifizéieren, héich MNA-Niveauen an T-Zellen op d'Präsenz vun engem immunsuppressiven CAF-Mikroëmfeld hiweise kënnen.
Wéinst dem niddregen Expressiounsniveau vun MNA-Transporter an den ondetektéierbare Niveaue vu Schlësselproteinen, déi am MNA-Metabolismus involvéiert sinn, ass d'Präsenz vun MNA an T-Zellen onerwaart. Weder NNMT nach AOX1 konnten duerch scRNA-seq-Analyse an gezielte qPCR vun zwou onofhängege Kohorten nogewise ginn. Dës Resultater weisen drop hin, datt MNA net vun T-Zellen synthetiséiert gëtt, mä vun den ëmleienden TME absorbéiert gëtt. In-vitro-Experimenter weisen, datt T-Zellen tendéieren, exogen MNA ze accumuléieren.
Eis In-vitro-Studien hunn gewisen, datt exogen MNA d'Expressioun vun TNFα an T-Zellen induzéiert an d'Bindung vu Sp1 un den TNFα-Promoter verbessert. Obwuel TNFα souwuel Anti-Tumor- wéi och Anti-Tumor-Funktiounen huet, kann TNFα bei Eierstockkriibs de Wuesstum vun Eierstockkriibs förderen (31-33). D'Neutraliséierung vun TNFα an der Eierstocktumorzellkultur oder d'Eliminatioun vum TNFα-Signal a Mausmodeller kann d'Produktioun vun TNFα-vermittelten inflammatoreschen Zytokinen verbesseren an den Tumorwuesstum hemmen (32, 35). Dofir kann an dësem Fall TME-ofgeleet MNA als pro-inflammatoresche Metabolit iwwer en TNFα-ofhängegen Mechanismus duerch den autokrinen Schleife wierken, wouduerch d'Optriede a Verbreedung vun Eierstockkriibs gefördert gëtt (31). Baséierend op dëser Méiglechkeet gëtt d'TNFα-Blockad als potenziell therapeutescht Mëttel fir Eierstockkriibs ënnersicht (37, 48, 49). Zousätzlech schwächt MNA d'Zytotoxizitéit vu CAR-T-Zellen op Eierstocktumorzellen, wat weider Beweiser fir MNA-vermittelten Immunsuppressioun liwwert. Zesummegefaasst suggeréieren dës Resultater e Modell, an deem Tumoren a CAF-Zellen MNA an extrazellulär TME sekretéieren. Duerch (i) TNF-induzéiert Stimulatioun vum Eierstockkriibswuesstem an (ii) MNA-induzéiert Hemmung vun der zytotoxescher Aktivitéit vun T-Zellen kéint dëst en duebelen Tumoreffekt hunn (Figur 5D).
Schlussendlech huet dës Studie, andeems eng Kombinatioun aus schneller Zellanreicherung, Eenzelzell-Sequenzéierung a metabolischer Profiléierung ugewannt gouf, déi enorm immunometabolomesch Ënnerscheeder tëscht Tumoren an Asziteszellen bei HGSC-Patienten opgedeckt. Dës ëmfaassend Analyse huet gewisen, datt et Ënnerscheeder an der Glukosopnahm an der mitochondrialer Aktivitéit tëscht T-Zellen gëtt, an huet MNA als en net-zellméissegen autonomen immunreguléierenden Metabolit identifizéiert. Dës Donnéeën hunn en Afloss drop, wéi TME den T-Zellmetabolismus bei mënschleche Kriibs beaflosst. Och wann déi direkt Konkurrenz ëm Nährstoffer tëscht T-Zellen a Kriibszellen gemellt gouf, kënne Metabolitte och als indirekt Reguléierer handelen, fir d'Tumorprogressioun ze fërderen an eventuell endogen Immunantworten z'ënnerdrécken. Déi weider Beschreiwung vun der funktioneller Roll vun dëse regulatoresche Metabolitte kéint alternativ Strategien opmaachen, fir d'Antitumor-Immunantwort ze verbesseren.
Patienteprouwen a klinesch Donnéeë goufen iwwer de BC Kriibstumorgewebe-Repository gesammelt, dee vum Canadian Tissue Repository Network zertifizéiert ass. Geméiss dem Protokoll, dee vum BC Cancer Research Ethics Committee an der University of British Columbia (H07-00463) guttgeheescht gouf, hunn all Patienteprouwen a klinesch Donnéeën hir schrëftlech Zoustëmmung kritt oder hir Zoustëmmung formell verzicht. D'Prouwen ginn an der zertifizéierter BioBank (BRC-00290) gespäichert. Detailéiert Patienteeigenschaften sinn an den Tabellen S1 an S5 gewisen. Fir d'Kryokonservéierung gëtt e Skalpell benotzt fir d'Tumorprouf vum Patient mechanesch ze zersetzen an se dann duerch e 100-Mikronfilter ze drécken fir eng eenzel Zellsuspensioun ze kréien. Den Aszites vum Patient gouf 10 Minutte laang bei 4°C mat 1500 rpm zentrifugéiert fir d'Zellen ze pelletéieren an den Iwwerstand ze entfernen. Zellen, déi aus Tumoren an Aszites gewonnen goufen, goufen a 50% hëtzeinaktivéiertem mënschlechen AB-Serum (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) an 10% Dimethylsulfoxid kryokonservéiert. Dës konservéiert Eenzelzellausspensionen goufen opgetaut a fir d'Metabolomik an d'Metabolitbestëmmung benotzt, déi hei ënnendrënner beschriwwe ginn.
Dat komplett Medium besteet aus 0,22 μm gefiltertem 50:50 ergänztem RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-Glutamin (Thermo Fisher Scientific) ergänzt mat 10% hëtzeinaktiviéiertem mënschlechen AB-Serum (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-Glutamin (Thermo Fisher Scientific), Fisher Scientific, 1 x Penicillin-Streptomycin-Léisung (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) an 50 μMB-Mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) gëtt mat 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) an 2 mM l-Glutamin (Thermo Fisher Scientific) ergänzt. De Flowcytometer-Färbungspuffer bestoung aus 0,22 μm gefiltertem Phosphat-gepuffertem Salzléisung (PBS; Invitrogen) ergänzt mat 3% hëtzeinaktiviéiertem AB-Mënschleche Serum (Sigma). De Zellanreicherungspuffer besteet aus 0,22 μm gefiltertem PBS a ergänzt mat 0,5% hëtzeinaktivéiertem mënschlechen AB-Serum (Sigma-Aldrich).
An engem komplette Medium bei 37°C goufen d'Zellen 30 Minutte laang mat 10 nM MT DR an 100 μM 2-NBDG gefierft. Duerno goufen d'Zellen 15 Minutte laang mat dem Viabilitéitsfaarfstoff eF506 bei 4°C gefierft. Resuspendéiert d'Zellen am FC Block (eBioscience) a Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), verdënnt se am Flowcytometrie-Färbungspuffer (no den Instruktioune vum Hiersteller) an inkubéiert se 10 Minutte laang bei Raumtemperatur. Fiert d'Zellen 20 Minutte laang mat engem Set Antikörper (Tabell S2) am Flowcytometrie-Färbungspuffer bei 4°C. Resuspendéiert d'Zellen virun der Analyse am Flowcytometrie-Färbungspuffer (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R). Benotzt SpectroFlo a FlowJo V10 fir d'Zellzueldaten z'analyséieren, a benotzt GraphPad Prism 8 fir d'Donnéeën ze erstellen. Déi median Fluoreszenzintensitéit (MFI) vun 2-NBDG an MT DR gouf log-normaliséiert, an duerno gouf en gepaarten t-Test fir d'statistesch Analyse benotzt fir iwwereneestëmmend Patienten ze berücksichtegen. All Populatiounen mat manner wéi 40 Eventer aus der Analyse ewechhuelen; en MFI-Wäert vun 1 fir all negativ Wäerter aginn, ier eng statistesch Analyse an eng Datenvisualiséierung duerchgefouert ginn.
Fir d'manuell Gating-Strategie vum uewe genannten Prozesspanel ze ergänzen, hu mir déi komplett Annotatioun vum Shape Restriction Tree (FAUST) (21) benotzt, fir automatesch Zellen der Populatioun zouzeweisen, nodeems dout Zellen am FlowJo eliminéiert goufen. Mir verwalten den Output manuell, fir Populatiounen ze fusionéieren, déi falsch zougewise schéngen (PD1+ mat PD1-Tumorzellen kombinéieren) a behalen Populatiounen. All Prouf enthält am Duerchschnëtt méi wéi 2% Zellen, fir insgesamt 11 Populatiounen.
Ficoll-Gradientdichtzentrifugatioun gouf benotzt fir PBMC vu Leukozyten-Trennungsprodukter ze trennen (STEMCELL Technologies). CD8+ T-Zellen goufen aus PBMC mat CD8 MicroBeads (Miltenyi) isoléiert an a komplettem Medium mat TransAct (Miltenyi) fir 2 Wochen expandéiert, no den Instruktioune vum Hiersteller. D'Zellen kruten 5 Deeg a komplettem Medium mat IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) stoe gelooss an duerno mat TransAct nei stimuléiert. Um 7. Dag goufen, no den Instruktioune vum Hiersteller, mënschlech CD45 MicroBeads (Miltenyi) benotzt fir d'Zellen an dräi hannereneen Ronnen anzeräumen. D'Zellen goufen fir d'Flowcytometrie-Analyse (wéi uewe beschriwwen) aliquotéiert, an eng Millioun Zellen goufen dräimol fir d'LC-MS/MS-Analyse aliquotéiert. D'Prouwe goufen duerch LC-MS/MS veraarbecht, wéi hei ënnendrënner beschriwwen. Mir hunn de fehlende Metabolitwäert mat enger Ionenzuel vun 1.000 geschat. All Prouf gëtt duerch d'Gesamtionenzuel (TIC) normaliséiert, logarithmesch ëmgerechent an automatesch am MetaboAnalystR normaliséiert virun der Analyse.
Déi eenzel Zellsuspensioun vun all Patient gouf opgetaut a duerch e 40 μm Filter an e komplett Medium gefiltert (wéi uewe beschriwwen). Geméiss dem Protokoll vum Hiersteller goufen dräi hannereneen Ronnen vun positiver Selektioun duerch Magnéitperlentrennung mat MicroBeads (Miltenyi) benotzt fir d'Prouwe fir CD8+, CD4+ an CD45- Zellen (op Äis) anzereicheren. Kuerz gesot, d'Zellen ginn an engem Zellanreicherungspuffer (wéi uewe beschriwwen) resuspendéiert a gezielt. D'Zellen goufen 15 Minutte laang mat mënschlechen CD8-Perlen, mënschlechen CD4-Perlen oder mënschlechen CD45-Perlen (Miltenyi) bei 4°C inkubéiert an duerno mat Zellanreicherungspuffer gewäsch. D'Prouf gëtt duerch d'LS-Kolonn (Miltenyi) geleet, an déi positiv an negativ Fraktioune ginn gesammelt. Fir d'Dauer ze reduzéieren an de Zellgewinnungsschratt ze maximéieren, gëtt d'CD8-Fraktioun dann fir déi zweet Ronn vun der CD4+-Anreicherung benotzt, an d'CD4-Fraktioun fir déi spéider CD45-Anreicherung. Halt d'Léisung während dem ganze Separatiounsprozess op Äis.
Fir d'Prouwe fir d'Metabolitanalyse virzebereeden, goufen d'Zellen eemol mat äiskaler Salzléisung gewäsch, an 1 ml 80% Methanol gouf zu all Prouf bäigefüügt, duerno gevirbelt an a flëssege Stéckstoff séier agefruer. D'Prouwe goufen dräimol Gefrier-Optau-Zyklen ënnerworf a bei 14.000 rpm fir 15 Minutten bei 4°C zentrifugéiert. Den Iwwerstand mat de Metabolitte gëtt verdampft bis en dréchen ass. D'Metabolitte goufen an 50 μl 0,03% Ameensäure nei opgeléist, gevirbelt fir ze vermëschen, an duerno zentrifugéiert fir Reschter ze entfernen.
Extrahéiert Metabolitte wéi uewe beschriwwen. Transferéiert den Iwwerstand an eng Héichleistungsflëssegkeetschromatographie-Fläsch fir d'Metabolomikfuerschung. Benotzt e zoufällegt Behandlungsprotokoll fir all Prouf mat enger ähnlecher Zuel vun Zellen ze behandelen, fir Batch-Effekter ze vermeiden. Mir hunn eng qualitativ Bewäertung vu globale Metabolitte gemaach, déi virdru um AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) publizéiert goufen. Chromatographesch Analyse an Peak-Flächenintegratioun goufen mat der MultiQuant Versioun 2.1 Software (Applied Biosystems SCIEX) duerchgefouert.
Eng Ionenzuel vun 1000 gouf benotzt fir de fehlende Metabolitwäert ze schätzen, an den TIC vun all Prouf gouf benotzt fir déi normaliséiert Peakfläch vun all detektéierte Metabolit ze berechnen, fir Ännerungen ze korrigéieren, déi duerch d'instrumentell Analyse vun der Proufveraarbechtung agefouert goufen. Nodeems den TIC normaliséiert gouf, gëtt MetaboAnalystR(51) (Standardparameter) fir logarithmesch Konversioun an automatesch Normlinnskaléierung benotzt. Mir hunn PCA mat veganem R-Package benotzt fir eng explorativ Analyse vun Metabolomënnerscheeder tëscht Prouftypen duerchzeféieren, an hunn eng partiell Redundanzanalyse benotzt fir Patienten z'analyséieren. Mir hunn d'Ward-Method benotzt fir en Hëtzekaart-Dendrogramm ze konstruéieren fir den euklideschen Ofstand tëscht de Proufen ze gruppéieren. Mir hunn Limma (52) op standardiséiert Metabolit-Heefegkeet benotzt fir differenziell heefeg Metabolitten iwwer den gesamten Zelltyp a Mikroumfeld z'identifizéieren. Fir d'Erklärung ze vereinfachen, benotze mir de Gruppmëttelparameter fir de Modell ze spezifizéieren, a betruechten d'Zelltypen an der Mikroumfeld als all Grupp (n = 6 Gruppen); Fir den Signifikanztest hu mir dräi widderholl Miessunge fir all Metabolit duerchgefouert. Fir falsch Replikatioun ze vermeiden, gouf de Patient als Hindernis am Limma-Design abegraff. Fir d'Ënnerscheeder an de Metabolitten tëscht verschiddene Patienten ze kontrolléieren, hu mir de Limma-Modell ugepasst, andeems mir d'Patienten op eng fix Manéier abegraff hunn. Mir berichten iwwer d'Signifikanz vum virdefinéierte Kontrast tëscht dem Zelltyp an der Mikroumgebung vum Padj <0,05 (Benjamini-Hochberg-Korrektur).
Nom Vigoranreicherung mam Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% Viabilitéit) gouf d'Sequenzéierung vun Eenzelzell-Transkriptomen op de gesamte liewegen agefruerenen Aszites- an Tumorprouwen mat engem 10x 5'-Genexpressionsprotokoll duerchgefouert. Fënnef Fäll mat passenden Tumoren an Aszites goufen analyséiert, obwuel déi niddreg Viabilitéit vun enger Tumorprouf seng Inklusioun verhënnert huet. Fir verschidde Selektioune vu Patienten z'erreechen, hu mir d'Prouwen vun all Patient an de Spueren vum 10x Chrom-Controller kombinéiert an d'Aszites- an Tumorplazen separat analyséiert. Nom Sequenzéieren [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp gepaarten Enn (PE), Quebec Genom; en Duerchschnëtt vun 73.488 an 41.378 Liesungen pro Zell fir Tumor respektiv Aszites]], hu mir CellSNP a Vireo (53) benotzt (baséiert op CellSNP als De gemeinsame mënschleche SNP (VCF), dee vu GRCh38 geliwwert gëtt, kritt eng Donoridentitéit zougewisen. Mir benotzen SNPRelate fir déi nooste Identitéit (IBS) vum Genotypstatus (IBS) vum Patient ofzeschléissen, ouni net zougewisen Zellen an Zellen, déi als Duplexen identifizéiert goufen an déi tëscht Aszites- an Tumorprouwen passen (54). Op Basis vun dëser Aufgab hu mir dräi Fäll mat enger iwwerflossender Zellrepresentatioun am Tumor an Aszites fir d'Downstreamanalyse behalen. Nodeems mir e Massefiltratiounsschratt an der Scater (55) a Scran (56) BioConductor-Verpackung duerchgefouert hunn, huet dëst 6975 Zellen (2792 an 4183 Zellen aus Tumor respektiv Aszites) fir d'Analyse erginn. Mir benotzen igraph seng (57) Louvain Clustering vum Shared Neighbor Network (SNN) baséiert op der Jaccard-Distanz zu Clusterzellen no Expressioun. Den Cluster goufen manuell op potenziell Zelltypen baséiert op der Markergenexpressioun annotéiert a mat t-SNE visualiséiert. Zytotoxesch T-Zellen gi vun der Expressioun vu CD8A a GZMA definéiert, ausser Subcluster mat gerénger ribosomaler Proteinexpressioun. Mir hunn op déi publizéiert Donnéeën vum Izar et al. (16) zougegraff, dorënner hir t-SNE-Embedding, déi d'Iwwerlappung vun der Expressioun tëscht Immunzellmarker an NNMT-Expressioun kontrolléiere kënnen.
PBMC goufen duerch Ficoll-Gradientdichtzentrifugatioun vu Leukozyten-Trennungsprodukter (STEMCELL Technologies) getrennt. CD3+ Zellen goufen aus PBMC mat CD3-Perlen (Miltenyi) isoléiert. Bei Präsenz oder Absenz vun MNA goufen CD3+ Zellen mat plackegebonnenem CD3 (5μg/ml), löslechem CD28 (3μg/ml) an IL-2 (300 U/ml; Proleukin) aktivéiert. Um leschten Dag vun der Expansioun goufen d'Viabilitéit (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) an d'Proliferatioun (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) duerch Flusszytometrie evaluéiert. D'Effektorfunktioun gëtt evaluéiert andeems d'Zellen mat PMA (20 ng/ml) an Ionomycin (1μg/ml) mat GolgiStop fir 4 Stonnen stimuléiert ginn, an CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) an TNFα-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) (MAb11, BD) iwwerwaacht ginn. QPCR- an ChIP-Zellen mat PMA (20 ng/ml) an Ionomycin (1μg/ml) fir 4 Stonnen stimuléiert ginn. Den ELISA-Iwwerstand gouf virun an no der Stimulatioun mat PMA (20 ng/ml) an Ionomycin (1 μg/ml) fir 4 Stonnen gesammelt.
Follegt dem Protokoll vum Hiersteller fir RNA mat dem RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ze isoléieren. Benotzt QIAshredder (QIAGEN) fir d'Prouf ze homogeniséieren. Benotzt en High-Capacity RNA to cDNA Kit (Thermo Fisher Scientific) fir komplementär DNA (cDNA) ze synthetiséieren. Benotzt den TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) fir d'Genexpression (geméiss dem Protokoll vum Hiersteller) mat de folgende Sonden ze quantifizéieren: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [Glyceraldehyd-3-phosphat of Hydrogen (GAPDH)] an Hs01010726_m1 (SLC22A2). D'Prouwen goufen um StepOnePlus Echtzäit-PCR-System (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) an der MicroAmp Fast Optical 96-Well-Reaktiounsplack (Applied Biosystems) mat MicroAmp opteschem Film getest. All Ct-Wäert, deen iwwer 35 läit, gëtt als iwwer dem Detektiounsschwellwäert ugesinn a gëtt als net detektéierbar markéiert.
Féiert ChIP wéi virdru beschriwwen aus (58). Kuerz gesot, d'Zellen goufen mat Formaldehyd (Endkonzentratioun 1,42%) behandelt an 10 Minutten bei Raumtemperatur inkubéiert. Benotzt ergänzte Schwellpuffer (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl an 0,1% NP-40) op Äis fir 10 Minutten, an dann resuspendéiert am Immunoprezipitatiounspuffer wéi beschriwwen (58). D'Prouf gouf dann mat de folgende Zyklen sonikéiert: 10 Zyklen (20 1-Sekonnen-Impulser) an eng statesch Zäit vu 40 Sekonnen. Inkubéiert ChIP-Grad Immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), Histon H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) an SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) Antikörper mat der Prouf bei 4°CC a schëddelt se iwwer Nuecht. Inkubéiert Protein-A-Perlen (Thermo Fisher Scientific) mat der Prouf bei 4°C ënner sanftem Schüttelen fir 1 Stonn, benotzt dann Chelex-Perlen (Bio-Rad) fir d'DNA anzeräicheren, a benotzt Proteinase K (Thermo Fisher) fir d'Proteinverdauung. Den TNFα-Promotor gouf duerch PCR detektéiert: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; am Géigendeel, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp Produkt). D'Biller goufe vum Image Lab (Bio-Rad) produzéiert a mat der ImageJ Software quantifizéiert.
Den Iwwerstand vun der Zellkultur gouf wéi uewe beschriwwe gesammelt. D'Bestimmung gouf no de Prozedure vum Hiersteller vum mënschlechen TNFα ELISA Kit (Invitrogen), mënschlechen IL-2 ELISA Kit (Invitrogen) a mënschlechen IFN-γ ELISA Kit (Abcam) duerchgefouert. Geméiss dem Protokoll vum Hiersteller gouf den Iwwerstand 1:100 verdënnt fir TNFα an IL-2 ze detektéieren, an 1:3 fir IFN-γ ze detektéieren. Benotzt den EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) fir d'Absorptioun bei 450 nm ze moossen.
PBMC goufen duerch Ficoll-Gradientdichtzentrifugatioun vu Leukozyten-Trennungsprodukter (STEMCELL Technologies) getrennt. CD3+ Zellen goufen aus PBMC mat CD3-Perlen (Miltenyi) isoléiert. Egal ob MNA dobäi ass, goufen CD3+ Zellen mat plackegebonnenem CD3 (5μg/ml), löslechem CD28 (3μg/ml) an IL-2 (300 U/ml; Proleukin) fir 3 Deeg aktivéiert. No 3 Deeg goufen d'Zellen gesammelt a mat 0,9% Salzléisung gewäsch, an de Pellet gouf séier agefruer. D'Zellzuelung gouf duerch Flusszytometrie (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R Konfiguratioun) mat 123count eBeads duerchgefouert.
Extraktmetabolitte wéi uewe beschriwwen. Den gedréchenten Extrakt gouf mat enger Konzentratioun vu 4000 Zellequivalenten/μl rekonstituéiert. Analyséiert d'Prouf duerch Reverse-Phase-Chromatographie (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) an enger CORTECS T3-Sail (2,1 × 150 mm, Partikelgréisst 1,6 μm, Poregréisst 120 Å; #186008500, Waters). Polare Massespektrometer (6470, Agilent), bei deem d'Elektrospray-Ioniséierung am positive Modus funktionéiert. Mobil Phase A ass 0,1% Ameensäure (an H2O), mobil Phase B ass 90% Acetonitril, 0,1% Ameensäure. Den LC-Gradient ass 0 bis 2 Minutten fir 100% A, 2 bis 7,1 Minutten fir 99% B, an 7,1 bis 8 Minutten fir 99% B. Dann d'Kolonn mat der mobiler Phase A mat enger Duerchflussrate vun 0,6 ml/min fir 3 Minutten nees an d'Gläichgewiicht bréngen. D'Duerchflussrate ass 0,4 ml/min, an d'Kolonnekammer gëtt op 50°C erhëtzt. Benotzt den MNA säi pure chemesche Standard (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) fir d'Retentiounszäit (RT) an d'Transformatioun ze bestëmmen (RT = 0,882 Minutten, Transformatioun 1 = 137→94,1, Transformatioun 2 = 137→92, Konversioun 3 = 137→78). Wann all dräi Iwwergäng zur korrekter Retentiounszäit optrieden, gëtt den Iwwergang 1 fir d'Quantifizéierung benotzt fir d'Spezifizitéit ze garantéieren. D'Standardkurve vun MNA (Toronto Research Chemical Company) gouf duerch sechs seriell Verdënnungen vun der Stammléisung (1 mg/ml) generéiert, fir Standarden vun 0,1, 1,0, 10 an 100 ng/ml respektiv 1,0 an 10μg/ml Flëssegkeet ze kréien. D'Detektiounsgrenz ass 1 ng/ml, an d'linear Äntwert läit tëscht 10 ng/ml an 10μg/ml. All Injektioun vun zwee Mikroliter Prouf a Standard gëtt fir d'LC/MS-Analyse benotzt, an all aacht Injektiounen gëtt eng gemëschte Qualitéitskontrollprouf duerchgefouert, fir d'Stabilitéit vun der Analyseplattform ze garantéieren. D'MNA-Äntwerten vun alle mat MNA behandelten Zellprouwen ware bannent dem lineare Beräich vum Assay. D'Datenanalyse gouf mat der MassHunter quantitativer Analysesoftware (v9.0, Agilent) duerchgefouert.
Den αFR-CAR-Konstrukt vun der zweeter Generatioun gouf vum Song et al. (59) iwwerholl. Kuerz gesot, enthält de Konstrukt déi folgend Inhalter: CD8a-Leadersequenz, mënschlecht αFR-spezifescht Eenzelkette-Variabelfragment, CD8a-Scharnier- a Transmembranregioun, CD27-Zellulardomän an CD3z-Zellulardomän. Déi komplett CAR-Sequenz gouf vu GenScript synthetiséiert an duerno an de Lentiviral-Expressiounsvektor vun der zweeter Generatioun virum GFP-Expressiounskassett geklont, deen benotzt gouf fir d'Transduktiounseffizienz ze evaluéieren.
De Lentivirus gëtt duerch Transfektioun vun HEK293T Zellen [American Type Culture Collection (ATCC]] produzéiert; an Dulbecco's modifizéiertem Eagle Medium mat 10% fetaltem Rinderserum (FBS) an 1% PenStrep ugebaut, a mat CAR-GFP Vektor an D'Verpackungsplasmiden (psPAX2 an pMD2.G, Addgene) benotzen Lipofektiounsamin (Sigma-Aldrich). Den virushaltegen Iwwerstand gouf 48 an 72 Stonnen no der Transfektioun gesammelt, gefiltert an duerch Ultrazentrifugatioun konzentréiert. De konzentréierte virale Iwwerstand bei -80°C bis zur Transduktioun späicheren.
PBMC ginn duerch Ficoll-Gradientdichtzentrifugatioun vu gesonde Leukocyten-Trennungsprodukter vun Donoren (STEMCELL Technologies) getrennt. Benotzt positiv Selektiouns-CD8-Mikrokugelen (Miltenyi) fir CD8+ Zellen aus PBMC ze isoléieren. Stimuléiert T-Zellen mat TransAct (Miltenyi) an an TexMACS-Medium [Miltenyi; ergänzt mat 3% Hëtzt-inaktivéiertem mënschleche Serum, 1% PenStrep an IL-2 (300 U/ml)]. Véieranzwanzeg Stonnen no der Stimulatioun goufen T-Zellen mat Lentivirus transduzéiert (10 μl konzentréiert Virus-Iwwerstand pro 106 Zellen). 1 bis 3 Deeg no der Transduktioun op Cytek Aurora (op FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+)) soll d'GFP-Expressioun vun den Zellen evaluéiert ginn, fir eng Transduktiounseffizienz vun op d'mannst 30% ze demonstréieren.
CAR-T-Zellen goufen 24 Stonnen am Immunocult (STEMCELL Technologies; ergänzt mat 1% PenStrep) ënner de folgende Konditioune kultivéiert: onbehandelt, behandelt mat 250 μM Adenosin oder 10 mM MNA. No der Virbehandlung goufen d'CAR-T-Zellen mat PBS gewäsch a mat 20.000 SK-OV-3-Zellen [ATCC; am McCoy 5A-Medium (Sigma-Aldrich) ergänzt mat 10% FBS an 1% PenStrep bei 10 kombinéiert: D'Effektor-Zil-Verhältnis vun 1 gouf dräimol am ergänzte Immunocult-Medium amplifizéiert. SK-OV-3-Zellen an SK-OV-3-Zellen, déi mat Digitalis-Saponin (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) lyséiert goufen, goufen als negativ respektiv positiv Kontrollen benotzt. No 24 Stonne Kokultivatioun gouf den Iwwerstand gesammelt an d'Laktatdehydrogenase (LDH) gouf no den Instruktioune vum Hiersteller gemooss (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Den LDH-Iwwerstand gouf 1:50 am LDH-Puffer verdënnt. De Prozentsaz vun der Ofstuerzung gouf mat der folgender Formel gemooss: Prozentsaz vun der Ofstuerzung = Prozentsaz vun der Korrektur / maximal Ofstuerzungsquote x 100%, wou Prozentsaz vun der Korrektur = Kokultur vun nëmmen T-Zellen, a maximal Ofstuerzungsquote = positiv Kontroll-negativ Kontroll.
Wéi am Text oder de Materialien a Methoden beschriwwen, benotzt GraphPad Prism 8, Microsoft Excel oder R v3.6.0 fir d'statistesch Analyse. Wa verschidde Prouwe vum selwechte Patient gesammelt ginn (wéi z.B. Aszites an Tumor), benotze mir en gepaarten t-Test oder integréiere de Patient als zoufällegen Effekt an engem linearen oder generaliséierte Modell, jee nodeem wat néideg ass. Fir d'Metabolomikanalyse gëtt den Wichtegkeetstest dräimol duerchgefouert.
Fir zousätzlech Materialien zu dësem Artikel, kuckt w.e.g. http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Dëst ass en Open-Access-Artikel, deen ënner de Bedéngunge vun der Creative Commons Attribution-Non-Commercial Lizenz verdeelt gëtt, déi d'Benotzung, d'Verdeelung an d'Reproduktioun an all Medium erlaabt, soulaang déi lescht Notzung net fir kommerzielle Gewënn ass an d'Viraussetzung ass, datt d'Originalwierk korrekt ass. Referenz.
Bemierkung: Mir froen Iech nëmmen Är E-Mailadress unzeginn, fir datt déi Persoun, déi Dir op der Säit recommandéiert, weess, datt Dir wëllt, datt si d'E-Mail gesäit an datt et kee Spam ass. Mir wäerten keng E-Mailadressen ophuelen.
Dës Fro gëtt benotzt fir ze testen ob Dir e Besucher sidd an automatesch Spam-Sendung ze verhënneren.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph G. Joness), Russell G. Joness (DeBussell G. Jones). Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA dréit zur Immunsuppressioun vun T-Zellen bäi a stellt e potenziellt Immuntherapie-Zil fir d'Behandlung vu Kriibs beim Mënsch duer.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph G. Joness), Russell G. Joness (DeBussell G. Jones). Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA dréit zur Immunsuppressioun vun T-Zellen bäi a stellt e potenziellt Immuntherapie-Zil fir d'Behandlung vu Kriibs beim Mënsch duer.
©2021 American Association for the Advancement of Science. all Rechter reservéiert. AAAS ass e Partner vun HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.